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厚德求是木蟲 (著名寫手)
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大腸桿菌BL-21（DE3）是否自帶降解外源重組蛋白的蛋白酶？ 已有1人參與
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如題所示，本人想向知情者討教關(guān)于“大腸桿菌BL-21（DE3）是否自帶降解外源重組蛋白的蛋白酶”的問題。 事情是這樣的，本人所做課題是關(guān)于提高某酶蛋白的熱穩(wěn)定性的。因此，在研究其熱穩(wěn)定性的時候，設(shè)計測定這個酶在某一溫度（例如40℃）下的半衰期。而在實驗過程中出現(xiàn)的問題是：酶在40℃下的半衰期太短了，實驗數(shù)據(jù)反應(yīng)出來的半衰期竟然是1,2分鐘；在其最適反應(yīng)溫度30℃下也超不過15min。但這個酶早在實際生產(chǎn)中得到了應(yīng)用，將同樣的帶有重組蛋白基因質(zhì)粒的大腸桿菌BL-21（DE3）做固定化，30℃左右生產(chǎn)可以達到半年時間。 因此我們在思考這個酶在破胞&熱處理后的失活原因（破胞后不做熱處理的粗酶，酶活還是正常的）。 有一種觀點是說大腸桿菌宿主內(nèi)的蛋白酶將外源重組蛋白降解了，因此我想請教各位的是，大腸桿菌BL-21（DE3）是不是自己帶降解外源重組蛋白的蛋白酶，把我的外源重組蛋白水解了？如果不是，那么是什么讓這個酶蛋白失活如此之快。 第二種觀點是破胞后的蛋白質(zhì)溶液組分復(fù)雜，不同的蛋白質(zhì)在溫度升高的時候相互作用，纏繞，使得目的酶蛋白失活。是否把帶有His標(biāo)簽的酶從粗酶液中純化后熱穩(wěn)定性會有提升？ |
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是這樣的：異源表達的蛋白質(zhì)如果不是體外表達，則需要進行破胞，最常用的就是用超聲波破胞。在目的蛋白質(zhì)本身穩(wěn)定性較差的情況下如果用水進行重懸破胞，很容易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致沒有活性。還有就是，用水重懸破胞得到的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性很低，遠遠低于緩沖液中的蛋白質(zhì)，我解決的方案就是用pbs緩沖液進行細胞重懸和破胞，之后得到的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性就好一些了。另外，自己在問題里面描述的那個蛋白質(zhì)酶的問題應(yīng)該是不存在的，既然大腸桿菌bl21（de3）已經(jīng)是一個成熟的宿主了，那么其中的那些限制性酶應(yīng)該已經(jīng)被敲出了。問這個問題時候我的實驗剛剛展開，什么都不懂。嘿嘿 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2015-10-14 13:16:08
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