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SHUHUI1988新蟲 (初入文壇)
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[求助]
急急急，熒光定量PCR引物及擴增效率求助~~~~~~~~~~~~~~~~
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這段時間一直在做定量PCR，是做室內(nèi)純菌培養(yǎng)的功能基因，所用的質(zhì)粒是找測序公司 合成的，然后返回的大腸桿菌，我自己培養(yǎng)后用qiagen試劑盒提取的，DNA是純菌提取RNA后反轉(zhuǎn)錄得到。然后一開始使用提取的質(zhì)粒直接作為模板做標準曲線，所有的標曲基本上R2值都可以在0.997~1左右，然后有一個基因glk基因擴增效率還不錯102%左右，后面連著標曲和樣品一起做，擴增效率也差不多，另外兩個基因soxb基因一個擴增效率一直在80%左右甚至60%多，另一個基因cbbl基因基本上稀釋梯度第三個之后的梯度就擴不出來的，在做標曲之前有做了定量，三個基因的反轉(zhuǎn)錄得到的DNA濃度基本上差不多。 后面聽大家說，那個是傳統(tǒng)的方法，現(xiàn)在發(fā)文章好像是要求不能直接用環(huán)狀質(zhì)粒做標曲的模板，需要線性化，然后我根據(jù)一個師兄的建議，直接用載體引物PCR跑膠后進行膠回收來純化的DNA，試劑盒也是qiagen的，結(jié)果這樣得到的純化后的DNA去做標曲，glk和soxb基因的標曲，R2值還是0.997~1左右，擴增效率卻一直在80%~90%直接，勉強偶爾到91%、92%左右但卻沒有重復(fù)性，而且也有做退火溫度梯度，從52~65℃左右，基本上都是80%多，沒有明顯的差，兩個基因都做退火溫度梯度了。也有把引物量提高，把體系中DNA的量也有該，各種都試了都不行，然后我做定量PCR的試劑盒是gotaq的試劑盒，里面的酶什么都是混合好的MIX，不知道應(yīng)該下一步怎么繼續(xù)了。另一個cbbl基因干脆擴增效率60%，懷疑是引物問題，重新又設(shè)計了3對引物，結(jié)果今天用這三對引物做溫度梯度，溶解曲線都是亂的，不知道是引物二聚體太多還是什么。。。 已經(jīng)是延期畢業(yè)了，實驗還是沒有進展，快要撐不住了�。。。。。。。。�！求助~~~~~~~~~~~~~~~ 還有，有人做過cbbl、glk、soxb、zwf、edd、eda這些基因的熒光定量么，有沒有比較好的引物推薦~~~~~~~~~~~~~~~ 謝謝！�。。。。。。。。。。。�！ |
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jifengyun321
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二月smile
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