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DB3.1高效感受態(tài)細(xì)胞制備問(wèn)題 已有2人參與
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蟲(chóng)友們： 有誰(shuí)在做感受態(tài)制備呀？最近遇到一個(gè)棘手問(wèn)題，我本站http://www.gaoyang168.com/html/200607/277251.html查到高效感受態(tài)細(xì)胞制備方法，其上說(shuō)：100ml培養(yǎng)基...........培養(yǎng)的菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國(guó)產(chǎn)分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。 請(qǐng)問(wèn)有人這么加了DMSO 嗎？還是大家都是加文中說(shuō)的：用1/12.5體積的TB懸浮, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘， 誰(shuí)能告訴我到底加多少DMSO合適？ |
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銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-06-24 12:08:40
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制備感受態(tài)細(xì)胞 準(zhǔn)備Inous轉(zhuǎn)化緩沖液（用前冰上預(yù)冷至0℃） 0.5mol/L的PIPES（pH 6.7）溶液的配制：將15.1g PIPES溶于80ml水中（Milli-Q級(jí)或與之相當(dāng)），用5mol/L KOH調(diào)pH至6.7，最后加純水，定容至100ml。用預(yù)先處理的Nalgene濾膜（0.45𝜇m）過(guò)濾除菌。分成小份于 -20℃保存。 Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液的配制：將下列組分溶于800ml純水中，然后加20ml 0.5mol/L的PIPES，加純水定容至1L。 試劑 需要量/L 終濃度 MnCl_2•4H_2O 10.88g 55mmol/L CaCl_2•2H_2O 2.20g 15mmol/L KCl 18.65g 250mmol/L PIPES（0.5mol/L,pH6.7） 20ml 10mmol/L H_2O 定容至1L C． 用預(yù)先處理的Nalgene濾膜（0.45𝜇m）過(guò)濾除菌。分成小份于 -20℃保存。 2． 挑取一個(gè)經(jīng)37℃培養(yǎng)16～20h 平板上的單菌落（2～3mm直徑），接種至250ml錐形瓶中的25ml LB或SOB培養(yǎng)液中37℃搖床（250～300rpm）培養(yǎng)6～8h。 3. 晚上約6點(diǎn)鐘，將上述初始培養(yǎng)物接種于三個(gè)盛有250ml SOB培養(yǎng)液的1L錐形瓶中，第一個(gè)加10ml，第二個(gè)加4ml，第三個(gè)加2ml，于18～22℃中搖床過(guò)夜。 4. 次日早上，測(cè)量三瓶培養(yǎng)物的OD_600值，每45min測(cè)定一次。 5. 當(dāng)有一瓶培養(yǎng)物OD_600=0.55時(shí)，將培養(yǎng)物至于冰上10min，棄去另兩瓶培養(yǎng)物。 6. 于4℃以2500g離心10min，收集菌體。 7. 倒去培養(yǎng)基，將離心管倒扣在吸水紙上2min以吸干生剩余液體，并將貼附在壁上的培養(yǎng)基吸干。 8. 加80ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液重懸細(xì)菌沉淀。（輕輕旋轉(zhuǎn)，不要震蕩或吹吸混勻） 9. 于4℃ 2500g離心10min收集菌體。 10. 倒去上層緩沖液，將離心管倒扣在吸水紙上2min以吸干剩余液體，并將壁上緩沖液吸干。 凍存感受態(tài)細(xì)胞 11. 用20ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液輕輕重懸沉淀。 12. 加1.5ml DMSO，輕輕混勻細(xì)菌懸液，冰上放置10min。 13. 迅速將懸液分裝到冷卻的無(wú)菌Ep管中，封緊管口，投入液氮中快速凍存感受態(tài)細(xì)胞。貯存于 -70℃?zhèn)溆谩? |
3樓2014-06-23 19:18:55
Neo2000
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4樓2014-06-24 12:01:28
大別克
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5樓2017-08-11 10:48:06
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