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monster_zeh金蟲 (小有名氣)
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[求助]
怎么確定一種生物中是否有某種酶 已有1人參與
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一種生物中是否有纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等等。 各位大俠，我是新手，請不吝賜教。 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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樣品中的特定的酶是否存在的實驗檢測方法 I.最簡單的一種方法：測定樣品中有沒有纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的生物活性，如果酶的活性沒有被抑制的話，也可以同時用有關(guān)的特定的酶的特征的紅外、可見光、紫外光光譜、原子光譜分析進行測定，尤其是這些酶有一些象NADH、FADH之類有機小分子輔基或輔酶或者含有有金屬離子時，后者用原子光譜分析。 但是以上只是證明樣品中可能有纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶，有可能存在與它們有同樣活性的其他物質(zhì)，甚至還不一定就是別的同種活性的生物酶。 II。精確的方法（沒有查到祥光酶的標(biāo)準(zhǔn)檢測試驗流程的前提下）：根據(jù)纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相對分子量進行分子篩層析或者其他的纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的標(biāo)準(zhǔn)分離方法，分離出同等分子量的生物大分子，然后測定其生物活性。接著用用有關(guān)的特定的酶的特征的紅外、可見光、紫外光光譜、原子光譜分析進行測定，尤其是這些酶有一些象NADH、FADH之類有機小分子輔基或輔酶或者含有有金屬離子時，后者用原子光譜分析。這樣基本上可以知道纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶在樣品中是否存在了，現(xiàn)在的有關(guān)酶試劑的商品說明一般可能查到常用的酶的檢測標(biāo)準(zhǔn)，也可以根據(jù)有關(guān)常用的酶的檢測標(biāo)準(zhǔn)，比如特征光譜、MS、HPLC、SDS PAGE電泳等完成檢測。 如果完全查不到有關(guān)的酶的檢測標(biāo)準(zhǔn)，而且檢測要求非常精確的做法，那么做法如下： 1.用HPLC或普通分子篩層析根據(jù)目的蛋白質(zhì)的相對分子量進行分離，也可以根據(jù)酶的推薦使用的其他分離方法，比如離子交換層析、親和層析等分離出目的蛋白質(zhì)，為了更加精確，一般最好在用非HPLC的情況下應(yīng)該使用HPLC進行一次完整蛋白質(zhì)的相對分子量鑒定或者用MS做一次分子量鑒定，同時也是鑒定純度，還可以用特征光譜、溶解法、SDS PAGE、WB等手段鑒定分離的蛋白質(zhì)的純度。一般這一步不要用肽譜分析，因為用了樣品就損失了，后面檢測還要接著做。MS損失樣品很少。這步實驗也盡量少用SDS PAGE或WB，因為SDS PAGE回收的蛋白質(zhì)不一定都能復(fù)性，WB的蛋白質(zhì)則損失了，影響后面的酶活性的測定。 2.酶的生物活性的測定。這一步取目的酶的最適反應(yīng)條件。酶的生物活性的測定不要放在第一步，因為樣品所處環(huán)境復(fù)雜，很可能目的酶的生活活性被抑制，不要第一步對于樣品檢測生物活性，發(fā)現(xiàn)沒有就此放棄。嚴(yán)格一些需要測定目的酶的比活性。 3.對于分離生物大分子對于此種生物大分子進行有限酶水解（通常用胰蛋白酶），可以再對于各個水解片段進行MS測定相對分子量；與此同時，用自動測序儀測定N末端和C末端各測定連續(xù)的15個氨基酸左右的氨基酸序列，或者對于此種生物大分子進行有限酶水解（水解酶視酶的相對分子量大小而定，不一定用胰蛋白酶，有必要的話可以用兩次不同的水解酶有限水解）后，分別對于兩個相鄰的水解片段分別用自動測序儀測定序列和用MS測定相對分子量（對于同一次有限水解的每一個蛋白質(zhì)片段只做一次測定，或者測序或者做MS測定相對分子量），如果這些數(shù)據(jù)都符合數(shù)據(jù)庫中的與目的酶來源及類型完全相同的酶。 分離時目的產(chǎn)物酶時，一般不要根據(jù)纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相對分子量使用SDS PAGE電泳分離目的蛋白質(zhì)，因為SDS PAGE回收的蛋白質(zhì)不一定都能復(fù)性；也盡量少用SDS PAGE或WB，WB的蛋白質(zhì)則損失了，這樣下一步就不能用生物活性方法測定是否存在目的酶。 有人可能可能認為：根據(jù)纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等酶的相對分子量使用SDS PAGE電泳分離目的蛋白質(zhì)，雖然SDS PAGE回收的蛋白質(zhì)不一定都能復(fù)性，但是可以用沒有限水解后，分別測定相鄰水解片段的序列和相對分子量之一（對于同一次有限水解的每一個蛋白質(zhì)片段只做一次測定，或者測序或者做MS測定相對分子量）。實際上SDS PAGE已經(jīng)使得蛋白質(zhì)變性，而復(fù)性可能也不是完全，可以用CD和紅外傅立葉光譜同時檢測，折疊狀態(tài)即使有生活性也可能不是生理狀態(tài)的構(gòu)象，因此有限酶水解可能與天然酶不一樣，所以分別測定相鄰水解片段的序列和相對分子量之一（對于同一次有限水解的每一個蛋白質(zhì)片段只做一次測定，或者測序或者做MS測定相對分子量）得到的數(shù)據(jù)可能與數(shù)據(jù)實際不符，除非有數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)就是這樣獲得的。 4.沒有條件做第三步實驗，則建議用CD、紅外傅立葉光譜、熒光光譜、紫外可見光光譜同時檢測第一步分離出的產(chǎn)物的特征光譜，同時結(jié)合第二步酶活性測定。這些都是陽性結(jié)果之后，再用SDS PAGE電泳或WB檢測一次，有條件可同時SDS PAGE電泳和WB，沒有條件，至少用一次SDS PAGE電泳。 |
5樓2014-07-09 09:51:13
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