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如果蘇西墮落鐵蟲 (初入文壇)
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不依賴鏈接反應(yīng)的克隆為什么不需要連接酶？ 已有2人參與
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| 我最近在學(xué)習(xí)Ligase Independent Cloning ，基本原理：T4 DNA聚合酶的3’—5’外切酶活性形成粘性末端，在退火反應(yīng)中具有同 源序列的載體和插入基因會(huì)連接起來；帶缺口和突出端的DNA復(fù)合物在細(xì)菌中能有效被修復(fù)。我的問題是，連接酶的作用是回復(fù)3，5-磷酸二酯鍵，如果LIC不需要連接酶，為什么傳統(tǒng)方法中限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端就需要DNA連接酶呢？ |
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2樓2014-07-14 10:48:03
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3樓2014-07-14 20:13:48
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4樓2014-07-16 16:47:01
【答案】應(yīng)助回帖
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傳統(tǒng)的連接反應(yīng)依賴sticky end, 只有3-5個(gè)堿基， 而兩條互補(bǔ)單鏈通過3-5個(gè)互補(bǔ)堿基形成的環(huán)狀DNA是不穩(wěn)定的，很容易分開，所以需要ligase把缺口補(bǔ)上。 而ligation independent method， 主動(dòng)制造20-30個(gè)互補(bǔ)單鏈。兩條互補(bǔ)單鏈通過20-30個(gè)互補(bǔ)堿基而形成的環(huán)狀DNA就穩(wěn)定多了，從而可以再導(dǎo)入細(xì)胞后在修復(fù)缺口。 |
5樓2014-07-17 08:04:09
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6樓2014-07-22 11:12:15
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