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[交流]
WB背景黑是什么原因？ 已有9人參與
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| 我做一個(gè)分子量為180kd的蛋白wb，用7%的分離膠，60v轉(zhuǎn)膜3h，5%milk封閉1h，一抗1：1000過夜（內(nèi)參b-actin 1：1000），TBST 30minx5，二抗1：5000孵育1h，TBST 10x3，ECL顯色，膠片曝光，內(nèi)參很清楚，也很干凈，但目的蛋白背景很黑，曝光之前肉眼都能看到整張膜都發(fā)亮，但條帶還能看出來(lái)，請(qǐng)教各位是什么原因。 |
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凌波麗
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
youlinglyw: 金幣+3 2014-07-18 12:55:07
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youlinglyw: 金幣+3 2014-07-18 12:55:07
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WB背景高的可能原因與解決方法 1.洗膜不充分，增加洗滌液的體積和洗滌次數(shù)；在洗滌液中加入Tween=20。 2.二抗?jié)舛冗^高，引起了一些非專一性的抗原-抗體相互作用，適當(dāng)降低二抗?jié)舛�，可以分梯度進(jìn)行。 3.二抗的識(shí)別抗原免疫簇不唯一，這是因?yàn)槎故嵌嗫寺】贵w，使用單克隆抗體的二抗，此時(shí)二抗的識(shí)別抗原免疫簇是唯一的，其非專一性的抗原-抗體相互作用會(huì)大為減少。當(dāng)然，有時(shí)，單克隆抗體也會(huì)有識(shí)別抗原免疫簇不唯一，如果兩種蛋白質(zhì)的抗原免疫簇的結(jié)構(gòu)很相近的話。如果不知道是不是二抗的識(shí)別抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情況下只加二抗實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)出是否為二抗的的抗原免疫簇的識(shí)別的原因，若是的話，可以先更換封閉試劑，若無(wú)效，則要同時(shí)更換二抗。 4.封閉不充分，增加封閉液的封閉時(shí)間，適當(dāng)提高溫度，更換封閉液。 5.曝光過度，縮短曝光時(shí)間。 6.檢測(cè)過程中膜干燥，保持充分的反應(yīng)液，避免膜干燥。 7．若無(wú)別的選擇，可嘗試選擇5%的脫脂奶粉，同時(shí)加入Tween=20。 8.滴定一抗或二抗的效價(jià)，找到一個(gè)產(chǎn)生清晰的信號(hào)強(qiáng)度可以接受的較低的抗體濃度。 9.縮短一抗和二抗的孵育時(shí)間。 |
7樓2014-07-18 10:26:56
0624410024
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