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[求助] taqman探針進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果分析已有2人參與

我需要擴(kuò)增的DNA序列是CACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTC（125bp）
設(shè)計(jì)的引物及探針如下
PRIMER  F: CACGCGGTTCTGGTATGA（18bp）
PRIMER  R: GAGCTCGAATTCGGATCC （18bp）
taqman探針（報(bào)告基團(tuán)JOE） CCGCTGCTGCTAAATTCGAAC （21bp）

實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增條件
93℃ 120s
93℃ 10s
60℃  30s，cycles45

但是結(jié)果如圖1，沒(méi)有明顯的熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線

我跑瓊脂糖凝膠電泳，圖2結(jié)果，1是marker，2是探針，3,是Taqman的擴(kuò)增結(jié)果4,是常規(guī)PCR結(jié)果

其中第三道有雜條帶，大家?guī)臀曳治鲆幌拢瑳](méi)有熒光的原因

fig.1.png

fig.2.jpg

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1樓 2014-07-23 15:34:24

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【答案】應(yīng)助回帖

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探針的TM值比引物高多少？

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2樓2014-07-23 16:31:47

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wyf625356

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2樓: Originally posted by vege的桌子 at 2014-07-23 16:31:47
探針的TM值比引物高多少？

引物是61.3，61.1，探針是69.7

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3樓2014-07-24 14:01:29

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jurkat.1640

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引物偏短，我的軟件預(yù)測(cè)你的引物Tm在54℃、56℃，Tm低。

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4樓2014-07-24 17:46:00

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4樓: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-24 17:46:00
引物偏短，我的軟件預(yù)測(cè)你的引物Tm在54℃、56℃，Tm低。

可是我擴(kuò)增條帶，跑膠是有的目的條帶的；另外我自己的軟件溫度是有60℃的

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5樓2014-07-25 09:12:24

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5樓: Originally posted by wyf625356 at 2014-07-25 09:12:24
可是我擴(kuò)增條帶，跑膠是有的目的條帶的；另外我自己的軟件溫度是有60℃的...

你用55℃退火條件看看

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6樓2014-07-25 11:11:20

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7樓2016-12-24 13:44:16

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永不言棄�。�

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8樓2019-08-27 13:45:33

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