馮可

新蟲 (初入文壇)

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[交流] SYBR 熒光定量PCR 陰性對照問題

反應(yīng)條件：
98℃ 2min
40循環(huán)
98℃ 30s
53.6℃ 30s
72℃ 30s
72℃  7min
反應(yīng)體系：
MightAmp mix （takara ） 10μL
引物（2μM）          1μL
引物（2μM）          1μL
模板                   2μL
水                      6μL
                                       20μL體系
問題：
1.前輩們看看我這個圖，無模板對照和陰性對照都出現(xiàn)擴(kuò)增是不是不行��？怎么去除呢？引物濃度調(diào)節(jié)我試過了，降低引物濃度是，陰性對照也會隨之消失，但是卻應(yīng)先檢出限。將循環(huán)數(shù)減少至30個循環(huán)，陰性擴(kuò)增會消失，但是不知道可不可性，同時還是影響檢出限。我在考慮增大退火溫度是否可行呢？
求大家指點(diǎn)。郁悶啊 ~~~ 小弟剛?cè)胧帧?br />
圖標(biāo)說明結(jié)果說明：
孔熒光基團(tuán) 樣本類型             Cq 解鏈溫度 1
A01-Ch5 SYBR 陽性對照    13.04 80.19
A02-Ch5 SYBR 陽性對照    13.17 80.13
A03-Ch5 SYBR 陽性對照    12.92 79.97
A04-Ch5 SYBR 陽性對照          17.81 80
C03-Ch5 SYBR 陽性對照          18.05 80.01
C01-Ch5 SYBR 無模板對照 32.32 80.17
C02-Ch5 SYBR 無模板對照 32.37 80.04
C05-Ch5 SYBR 陰性對照          32.68 79.93
C06-Ch5 SYBR 陰性對照             33.09 79.86

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1樓 2013-09-12 21:05:16

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86964109

木蟲 (小有名氣)

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laozuzunzhe: 金幣+1, 鼓勵交流！ 2013-09-13 17:14:19

你這個是不是存在氣溶膠污染啊

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2樓2013-09-13 08:16:53

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shwjs88

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以前碰到過，跑到別的樓上借了點(diǎn)水，高壓后再用，解決了。就是污染

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3樓2013-09-14 13:34:20

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cxfans

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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不用擔(dān)心我用的引物一直都有這樣的問題。理論上說ct在33以上算是超出檢測靈敏度范圍的不可信數(shù)據(jù)。而且我每次ntc都有這樣的現(xiàn)象，很難做到不出擴(kuò)增的陰性對照。有說法是在加模板時換到另外一個房間（有條件的可以單批出一個房間做定量），但我沒試過

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4樓2013-09-15 10:26:35

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sfj311

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我做的也是這樣，陰性很不穩(wěn)定，至今還沒找到答案

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5樓2014-09-15 10:56:34

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呂木木

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怎么做陰性對照啊，急死了

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6樓2016-01-25 01:27:00

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呂木木

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錯了，是怎么做陽性對照啊

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7樓2016-01-25 01:27:52

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kx361

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氣溶膠污染，之前我也遇見過，注意加試劑和加模板移液槍分開，兩個房間加樣，用過的垃圾缸及時清理，加樣順序，先試劑，后陰性對照，先樣品，加完后蓋上蓋子在加陽性模板，具體情況，具體對待。我一般40個循環(huán)，陰性對照沒有值

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8樓2016-01-25 05:53:05

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