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夢(mèng)飛zhu新蟲 (初入文壇)
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[求助]
熒光定量PCR ,條件優(yōu)化
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給位大俠,我想問一下: 1、熒光定量PCR ,條件具體怎么優(yōu)化,我具體從引物濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。 是不是優(yōu)化一個(gè)條件就需要做一次熒光定量(比如對(duì)熒光定量PCR體系中的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,分別做50、300、600、900 nm、1、10、20、30 μm引物濃度的優(yōu)化組合),還是一次熒光定量就可以把所有的優(yōu)化條件都解決了,進(jìn)行比較啊。 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,一般用什么標(biāo)準(zhǔn)品,稀釋濃度確定用分光光度計(jì)測(cè)定嗎? 新手,求助。 |
木蟲 (職業(yè)作家)
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是的,qPCR不像普通PCR那樣可以做梯度,調(diào)整一個(gè)條件就需要做一次。 我們常用到的qPCR supplies 及用量(1個(gè)反應(yīng),20ul體系)如下,樓主可根據(jù)這個(gè)用量適量調(diào)整: TBSYBRmix 10 ul PrimerF (10uM) 0.6 ul PrimerFR (10uM) 0.6 ul cDNA (20ng/ul) 2 ul Reference dye 0.4 ul ddH2O 6.4 ul |
木蟲 (著名寫手)
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