桃之夭夭pFly

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[求助] 實(shí)時(shí)熒光定量相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題

各位同仁：
我最近做相對(duì)定量，首先做標(biāo)準(zhǔn)曲線看內(nèi)參和目的基因的擴(kuò)增效率是否一致，在這個(gè)環(huán)節(jié)上一直無(wú)法突破。
問(wèn)題是：我的cDNA以10倍梯度稀釋了13個(gè)梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之間。我的體系是takela的，20ul
mix10
上0.4
下0.4
模板1
水8.2

95° 30s
95°5s
60°30s 40個(gè)循環(huán)

用的是96孔板，先把mix和上下，水混勻分裝后，再加模板。
mix用之前先顛倒混勻。
加樣時(shí)避免氣泡的產(chǎn)生。

我的cDNA是由天根的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得來(lái)的，用5ug的總RNA反轉(zhuǎn)錄成50ul的體系。

請(qǐng)各位幫我分析一下原因吧！做了3周了，一直這樣無(wú)進(jìn)展，很苦悶！謝謝您的分享和幫助了~

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1樓 2013-03-21 00:30:10

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桃之夭夭pFly

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求助啊求助！

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2樓2013-03-21 12:53:17

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【答案】應(yīng)助回帖

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桃之夭夭pFly: 金幣+10 2013-03-21 17:31:58

你是10倍稀釋的么？怎么會(huì)稀釋了13個(gè)梯度，Ct都差不多呢？沒(méi)稀釋好吧，或者有污染。

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3樓2013-03-21 13:37:10

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bunnyxia

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【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-04-27 14:45:25

起始的ct值不高，可以用PCR產(chǎn)物試試。稀釋梯度一般6、7個(gè)就行，可以5倍或10倍稀釋。稀釋時(shí)最好10ul稀釋到100ul，而且要混勻，不要相互污染。

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4樓2013-03-21 17:09:12

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3樓: Originally posted by phhcrab at 2013-03-21 13:37:10
你是10倍稀釋的么？怎么會(huì)稀釋了13個(gè)梯度，Ct都差不多呢？沒(méi)稀釋好吧，或者有污染。

我是吸1ul加9ul的水，吸打混勻后再吸1ul到另一個(gè)pcr管中，加9ul水，如此重復(fù)做的~‘
是不是擴(kuò)大成10ul加90ul的水這樣稀釋比較好？
你說(shuō)的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
謝謝你的回復(fù)~

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5樓2013-03-21 17:29:48

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4樓: Originally posted by bunnyxia at 2013-03-21 17:09:12
起始的ct值不高，可以用PCR產(chǎn)物試試。稀釋梯度一般6、7個(gè)就行，可以5倍或10倍稀釋。稀釋時(shí)最好10ul稀釋到100ul，而且要混勻，不要相互污染。

pcr產(chǎn)物？意思是用普通pcr擴(kuò)增我的目的基因后，再作為模板稀釋？
那我標(biāo)準(zhǔn)曲線這樣得出，我做相對(duì)定量的時(shí)候也要這樣嗎》？
謝謝你的回復(fù)~

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6樓2013-03-21 17:31:41

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我反正-信了

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我也一直在做這個(gè)，我用的也是TAKARA的，稀釋的梯度沒(méi)這么多，我是6個(gè)，外加三個(gè)重復(fù)和一個(gè)空白，也是10倍稀釋，但是按10——100ul來(lái)稀釋的反應(yīng)條件中我40Cycies中有三步：95 5s，58 31s，72 30s：其他都差不多，試劑也一樣！

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7樓2013-03-22 09:31:34

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你提的RNA有沒(méi)有去基因組污染呢
而且你做的時(shí)候改用八連管試一下，加樣順序：水>sybr green>引物>模板
試一下吧

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8樓2013-03-22 12:08:22

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phhcrab

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5樓: Originally posted by 桃之夭夭pFly at 2013-03-21 17:29:48
我是吸1ul加9ul的水，吸打混勻后再吸1ul到另一個(gè)pcr管中，加9ul水，如此重復(fù)做的~‘
是不是擴(kuò)大成10ul加90ul的水這樣稀釋比較好？
你說(shuō)的污染指的是哪一步怎么污染的呢？
謝謝你的回復(fù)~...

確實(shí)10ul加到90ul里會(huì)好很多的，混勻可以在渦旋振蕩器上晃一下，然后離心。反復(fù)吹打會(huì)增加掛壁的，更何況才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能發(fā)生的。比如實(shí)驗(yàn)環(huán)境、移液器、槍頭等等都可能存在污染的，如果你的樣品體系很小的話，一點(diǎn)污染造成的影響可能就很大了。

做定量最好是用帶濾芯的槍頭，如果沒(méi)這條件的話，那操作要更小心點(diǎn)。

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9樓2013-03-26 11:36:40

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9樓: Originally posted by phhcrab at 2013-03-26 11:36:40
確實(shí)10ul加到90ul里會(huì)好很多的，混勻可以在渦旋振蕩器上晃一下，然后離心。反復(fù)吹打會(huì)增加掛壁的，更何況才10ul。

未必是污染造成的，但是污染在哪一步都可能發(fā)生的。比如實(shí)驗(yàn)環(huán)境、移液器、槍頭等等都可能存在 ...

好的~謝謝了！近期發(fā)現(xiàn)是引物的退火溫度的問(wèn)題，提高到65°就好很多了~

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10樓2013-03-27 10:00:32

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