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實時熒光定量 相對定量 標準曲線的問題
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各位同仁: 我最近做相對定量,首先做標準曲線看內(nèi)參和目的基因的擴增效率是否一致,在這個環(huán)節(jié)上一直無法突破。 問題是:我的cDNA以10倍梯度稀釋了13個梯度,但是Ct值都很接近,都在19-21之間。我的體系是takela的,20ul mix10 上0.4 下0.4 模板1 水8.2 95° 30s 95°5s 60°30s 40個循環(huán) 用的是96孔板,先把mix和上下,水混勻分裝后,再加模板。 mix用之前先顛倒混勻。 加樣時避免氣泡的產(chǎn)生。 我的cDNA是由天根的反轉錄試劑盒得來的,用5ug的總RNA反轉錄成50ul的體系。 請各位幫我分析一下原因吧!做了3周了,一直這樣無進展,很苦悶!謝謝您的分享和幫助了~ |
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