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桃之夭夭pFly新蟲 (初入文壇)
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[求助]
實時熒光定量 相對定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題
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各位同仁： 我最近做相對定量，首先做標(biāo)準(zhǔn)曲線看內(nèi)參和目的基因的擴增效率是否一致，在這個環(huán)節(jié)上一直無法突破。 問題是：我的cDNA以10倍梯度稀釋了13個梯度，但是Ct值都很接近，都在19-21之間。我的體系是takela的，20ul mix10 上0.4 下0.4 模板1 水8.2 95° 30s 95°5s 60°30s 40個循環(huán) 用的是96孔板，先把mix和上下，水混勻分裝后，再加模板。 mix用之前先顛倒混勻。 加樣時避免氣泡的產(chǎn)生。 我的cDNA是由天根的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得來的，用5ug的總RNA反轉(zhuǎn)錄成50ul的體系。 請各位幫我分析一下原因吧！做了3周了，一直這樣無進(jìn)展，很苦悶！謝謝您的分享和幫助了~ |
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