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sunyu65045木蟲 (初入文壇)
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[求助]
A-T克隆重組質(zhì)粒篩選 菌落PCR 已有2人參與
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| 我使用pMD19-T對(duì)1600bp基因片段進(jìn)行A-T克隆，在含有Amp的LB平板上長(zhǎng)有少量的菌落，分別挑取半個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR，但是電泳確認(rèn)是發(fā)現(xiàn)所有菌落的條帶均一致但都小于目的片段（小于1000bp），PCR所用試劑均沒有問題以前使用過，請(qǐng)高手指教是哪里出現(xiàn)了問題，萬分感謝�。。。�！ |
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馨-馨
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2014-08-06 21:57:58
【答案】應(yīng)助回帖
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sunyu65045: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-08-07 15:13:13
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sunyu65045: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-08-07 15:13:13
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-你確定在基因片段兩端加上3‘A了么。如果沒有，可以用Taq酶加3’A再連接。 -pMD19-T應(yīng)該是可以做藍(lán)白斑篩選的吧，建議用LB AMP板加上IPTG+X-Gal做藍(lán)白斑篩選，挑白斑做PCR。白斑的插入率應(yīng)該有90%以上。 如果你現(xiàn)在已有LB AMP板，只需要加 100μl的100mM IPTG和 20μl的50mg/ml X-Gal在板上，涂抹均勻后37°C放置半個(gè)小時(shí)吸收IPTG和X-Gal，然后就可以用轉(zhuǎn)化菌液涂板了。 |
2樓2014-08-06 18:23:16
sunyu65045
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4樓2014-08-07 15:15:25
sunyu65045
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5樓2014-08-07 15:18:42
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