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lybio金蟲 (正式寫手)
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[求助]
終止密碼子附近序列是否有優(yōu)化問題 已有3人參與
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大家好！請(qǐng)教個(gè)問題。 前期插入載體片段的終止密碼子發(fā)生突變，未及時(shí)查出，進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量挺高的（載體本身有終止密碼子，C端比目標(biāo)蛋白多出10來個(gè)氨基酸，純化出的蛋白活性較標(biāo)準(zhǔn)品低了一個(gè)數(shù)量級(jí)）�，F(xiàn)將突變了的終止密碼子突變正常，而后連接與之前相同的表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)蛋白不表達(dá)了（重復(fù)做了多次，都是此結(jié)果）。請(qǐng)問各位大俠這是因什么原因造成的？ 查了些資料，有說“翻譯終止是蛋白生產(chǎn)必須的一步，更有效的翻譯終止導(dǎo)致更好的蛋白表達(dá)。如果終止密碼子附近序列沒有最佳化，可能發(fā)生明顯增加的翻譯通讀，因此減少了蛋白表達(dá)”。如果是因終止密碼子附近序列造成，又應(yīng)該如何優(yōu)化呢？ |
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4樓2014-08-08 11:35:24
songzuowei
木蟲 (著名寫手)
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2樓2014-08-08 10:29:11
kuaile5420
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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lybio: 金幣+5, ★★★很有幫助, 準(zhǔn)備弄條下游引物試試 2014-08-11 08:24:17
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絕大多數(shù)生物都有偏愛的圍繞終止密碼子的序列框架。酵母和哺乳動(dòng)物偏愛的終止密碼子分別是UAA和UGA。單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA。翻譯終止效率可能受緊接著終止密碼子的下游堿基和緊靠終止密碼子的上游序列影響。在酵母中通過改變圍繞終止密碼子的局部序列框架，翻譯終止效率可能被減低幾個(gè)100倍。對(duì)于UGA和UAA，緊接著終止密碼子的下游堿基對(duì)有效終止的影響力大小次序?yàn)镚>U，A>C；對(duì)于UAG是U、A>C>G。 對(duì)于大腸桿菌，翻譯終止效率可因終止密碼子及臨近的下游堿基的不同而顯著不同，從80%（UAAU）到7%（UGAC）。對(duì)于UAAN和UAGN系列，終止密碼子下游堿基對(duì)翻譯的有效終止的影響力大小次序?yàn)閁>G>A、C。UAG極少被大腸桿菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表現(xiàn)了有效的終止，但其后的堿基對(duì)有效終止的影響力為G>U，A>C。對(duì)于哺乳動(dòng)物，偏愛的終止密碼子為UGA，其后的堿基可以對(duì)in vivo翻譯終止有8倍的影響（A、G>>C、U）。對(duì)于UAAN系列，in vivo終止效率可以有70倍的差別，UGAN系列為8倍。如果終止密碼子附近序列沒有最佳化，可能發(fā)生明顯增加的翻譯通讀，因此減少了蛋白表達(dá)。例如，在兔網(wǎng)狀細(xì)胞無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)里，UGAC的翻譯通讀可以高達(dá)10%，而第四個(gè)堿基如果為A，G或C，翻譯通讀為<1%。 摘自http://www.bioon.com/experiment/nob2/86115.shtml。不知道對(duì)您是否有幫助？ |
3樓2014-08-08 11:29:06
5樓2014-08-08 13:16:17
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