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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 蛋白表達不出來是怎么回事？
| 查看: 3811 | 回復: 12 | |||
linsui1989新蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白表達不出來是怎么回事？
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我最近在做蛋白表達，重組質粒測序正確，但是表達出來和空載體一模一樣，沒有目的帶，請問是怎么回事？ 我用的是pet32a載體，酶切位點是BamH1和Xhol1,誘導溫度是37度，IPTG濃度1mmol/L, 菌株為rosseta,全菌電泳 |
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【答案】應助回帖
★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
linsui1989: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-12-04 15:05:40
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linsui1989: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-12-04 15:05:40
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第一步：確定載體序列是否正確，啟示子、終止子、讀碼框等； 第二步：確定操作步驟是否正確，如載體是否被污染，是否成功轉化入rossetta，抗生素是否正確等； 第三步：核對目的基因序列，與大腸桿菌常用密碼子作對比，優(yōu)化密碼子； 第四步：以上三步沒有問題時，若還不表達，更換載體； 第四步：更換載體還不表達，選擇GST、MBP、SUMO、GB1等助溶標簽融合表達。 另外，當目的蛋白太小或太大時可能都不易表達：小肽易被降解；太長例如大的膜蛋白等表達量往往也很難優(yōu)化。 當然，表達溫度以及誘導時間也會對蛋白的可溶表達有一定影響~ 但一般不會導致0和1的差別~ 祝實驗順利~ |
7樓2012-12-02 12:52:21
2樓2012-11-30 15:32:25
3樓2012-11-30 15:38:04
xiefl1984 
木蟲 (小有名氣)
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4樓2012-11-30 16:37:08
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
|
從樓主的條件來分析，溫度，IPTG濃度都已經挺高了，溫度試試降低一點看看，試試30攝氏度，27攝氏度之類的…… Rosseta本來就是用來表達稀有密碼子的受體細胞，一般來說很難表達的基因在Rosseta里面都可以表達的，你可以試試換下受體細胞，個人覺得Rosseta已經是很強悍的受體細胞了. 再個就要從樓主的表達載體的構建分析了，再仔細分析一下構建好的表達載體，測序沒？把測序結果好好分析一下，確定一下啟動子，跟閱讀框沒有出問題.實在不行換個表達載體吧，這是下下策了，換載體很多東西都要重新考慮，換個pGEX系列吧，GST融合表達.  祝樓主好運 |
8樓2012-12-02 13:47:16
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9樓2012-12-08 02:00:27
|
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10樓2013-04-26 20:25:55
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