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linsui1989新蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白表達不出來是怎么回事？
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我最近在做蛋白表達，重組質(zhì)粒測序正確，但是表達出來和空載體一模一樣，沒有目的帶，請問是怎么回事？ 我用的是pet32a載體，酶切位點是BamH1和Xhol1,誘導(dǎo)溫度是37度，IPTG濃度1mmol/L, 菌株為rosseta,全菌電泳 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
linsui1989: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-12-04 15:05:40
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第一步：確定載體序列是否正確，啟示子、終止子、讀碼框等； 第二步：確定操作步驟是否正確，如載體是否被污染，是否成功轉(zhuǎn)化入rossetta，抗生素是否正確等； 第三步：核對目的基因序列，與大腸桿菌常用密碼子作對比，優(yōu)化密碼子； 第四步：以上三步?jīng)]有問題時，若還不表達，更換載體； 第四步：更換載體還不表達，選擇GST、MBP、SUMO、GB1等助溶標(biāo)簽融合表達。 另外，當(dāng)目的蛋白太小或太大時可能都不易表達：小肽易被降解；太長例如大的膜蛋白等表達量往往也很難優(yōu)化。 當(dāng)然，表達溫度以及誘導(dǎo)時間也會對蛋白的可溶表達有一定影響~ 但一般不會導(dǎo)致0和1的差別~ 祝實驗順利~ |
7樓2012-12-02 12:52:21
2樓2012-11-30 15:32:25
3樓2012-11-30 15:38:04
xiefl1984 
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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從樓主的條件來分析，溫度，IPTG濃度都已經(jīng)挺高了，溫度試試降低一點看看，試試30攝氏度，27攝氏度之類的…… Rosseta本來就是用來表達稀有密碼子的受體細(xì)胞，一般來說很難表達的基因在Rosseta里面都可以表達的，你可以試試換下受體細(xì)胞，個人覺得Rosseta已經(jīng)是很強悍的受體細(xì)胞了. 再個就要從樓主的表達載體的構(gòu)建分析了，再仔細(xì)分析一下構(gòu)建好的表達載體，測序沒？把測序結(jié)果好好分析一下，確定一下啟動子，跟閱讀框沒有出問題.實在不行換個表達載體吧，這是下下策了，換載體很多東西都要重新考慮，換個pGEX系列吧，GST融合表達.  祝樓主好運 |
8樓2012-12-02 13:47:16
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
9樓2012-12-08 02:00:27
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10樓2013-04-26 20:25:55
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