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冷雁孤旅木蟲 (著名寫手)
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[求助]
求助QPCR擴(kuò)增效率的影響因素
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各位大俠，小弟在做QPCR（SYBR），在驗(yàn)證引物可用性的時候 1.使用的模板是普通PCR產(chǎn)物的模板（做的原核生物，為了節(jié)約CDNA）2 UL,按照10倍梯度稀釋 2.引物濃度時200MM 3.退火溫度是57.5℃ 4.擴(kuò)增條件：95℃ 30 S (1 CYCLE), 95℃ 5S（40 CYCLES） ,57.5℃ 31 S 20UL 體系 結(jié)果：溶解曲線是單峰，但是擴(kuò)增效率太高了，有的基因達(dá)到200%， 我想求教大俠：在不換引物的前提下：1.使用PCR產(chǎn)物模板，是否模板濃度太高會使得擴(kuò)增效率降低？ 2.退火溫度提高了，是否會使得擴(kuò)增效率降低？@西瓜 @biostar2009 @孫啟亮 @cicelyzh |
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冷雁孤旅
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9樓2015-08-27 23:20:38
2樓2014-08-18 16:18:09
冷雁孤旅
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3樓2014-08-19 00:14:39
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擴(kuò)增效率200%�。�！題主要考慮是否在模板稀釋過程中出現(xiàn)問題，是否存在高濃度樣品污染低濃度樣品的情況。具體的要看了你的擴(kuò)增曲線、溶解曲線以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果才能判斷。 其次題主提到的兩個問題 1、模板濃度過高會抑制PCR反應(yīng)，可能會導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低。但同時可能會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致結(jié)果的Ct值不可信，最終導(dǎo)致擴(kuò)增效率不可信。 2、在一定范圍內(nèi)提高退火溫度不會太影響擴(kuò)增效率。 |
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冷雁孤旅4樓2014-08-20 16:47:07
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