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andyzhengwp金蟲 (小有名氣)
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關于in-fusion PCR問題 已有4人參與
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我現(xiàn)在要將一個片段無縫的插入到一個質(zhì)粒的特定位點中，Clontech的In-Fusion試劑盒已經(jīng)買了，但是發(fā)現(xiàn)它需要將質(zhì)粒線性化，如果酶切線性化的話將不是無縫連接，會有幾個堿基多出來，質(zhì)粒有太大無法pcr方法線性化。 求助：1，有沒有好的方法師質(zhì)粒不加堿基線性化（酶切之后再PCR，肯定會在以前質(zhì)粒的基礎上多出幾個堿基來的）？ 2.或者有什么好的方法直接實現(xiàn)將一個片段無縫的插入到一個質(zhì)粒的特定位點中？ |
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ksws0465326
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andyzhengwp: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-08-20 09:07:10
andyzhengwp: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-08-20 09:07:10
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剛才看了下MAX的說明書，你的反應體系是怎樣的？還有反應條件？還有你的質(zhì)粒的濃度怎樣？根據(jù)說明書，再加上我個人感覺，反應體系中，如果是50μl體系，質(zhì)粒的終濃度最好不要超過1ng/50μl，其次，反應條件，你的退火，延伸溫度及相應時間怎么設定的？如果你退火溫度是55度5s，也可以嘗試下將溫度降到50試試，這兩天我做一個GXL就是，推薦60度降到50度才出來的，再有延伸溫度如果先前微72度，可以降到68度 按1kb/min試一試，再有就是循環(huán)數(shù)，說明書推薦30-35，也可以增大到40嘗試一下。純屬個人意見，我也在學習中。。呵呵，僅供參考。祝樓主早日成功！  |
6樓2014-08-19 21:35:11
xiaoweiwei121
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andyzhengwp: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-08-20 09:07:25
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經(jīng)常用這個infusion kit 如果引物沒問題，成功率沒得說，一般沒失過手，平板上陽性克隆90%以上。 不過我的載體4k多，設計了引物可以直接擴出來，沒嘗試過酶切的方法 樓主還是像樓上說的改善一下條件，擴一下吧 因為這個設計引物太重要了，曾經(jīng)犯了個錯誤，某個引物的重復序列后邊多了幾個堿基，就死活做不出來了 問了他們公司的技術支持，才知道的原因 |
7樓2014-08-20 00:55:05
2樓2014-08-19 12:40:35
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5樓2014-08-19 14:55:50
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8樓2014-08-20 09:09:11
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9樓2014-08-20 09:11:54
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【答案】應助回帖
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按正常情況的話，如果序列相同的質(zhì)粒和線性化條帶跑電泳，應該差不多，質(zhì)粒會稍微慢一點兒，但沒做過對比，不清楚，呵呵，一般我跑都是1%的膠100v跑40－50分鐘。。5000的marker可以分得很清。還有，單跑質(zhì)粒的時候有可能會出現(xiàn)兩倍或三倍于質(zhì)粒bp的條帶，跟人覺得這也有可能是質(zhì)粒重疊造成的。 |
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andyzhengwp10樓2014-08-20 11:19:16
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