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zisejiguan銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)照設(shè)置 已有2人參與
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大神好。最近在做流式，由于是新手，好多東西不明白。我在檢測(cè)我做的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中細(xì)胞陽(yáng)性率有多少，也就是純不純。陰性對(duì)照怎么設(shè)啊，我用的是沒(méi)有轉(zhuǎn)入目的蛋白的細(xì)胞染的一抗和二抗，效果很不理想啊。不知道是不是對(duì)照設(shè)的有問(wèn)題 另附上實(shí)驗(yàn)方法，看看步驟是不是哪里需要改進(jìn)的。 1. 收集細(xì)胞，Staining Buffer清洗細(xì)胞，最后剩100μL，渦旋重選細(xì)胞 2. 加入100μL固定液(4%多聚甲醛)，室溫孵育20min 3. 加入500μL破膜液（0.1%皂素），300-400g，室溫離心5min，棄上清 4. 500μL破膜液重懸細(xì)胞 5. 300-400g，室溫離心5min，棄上清 6. 100μL破膜液重懸細(xì)胞，加入一抗，孵育1h 7. 加入500μL破膜液，300-400g，室溫離心5min，棄上清 8. 重復(fù)步驟7 9. 100μL破膜液重懸細(xì)胞，加入熒光偶聯(lián)抗體孵育30min 10. 加入500μL破膜液，300-400g，室溫離心5min，棄上清 11. 重復(fù)步驟10 12. 用適量流式染色Buffer（PBS）重懸，上流式細(xì)胞儀分析。 PS: Staining Buffer：1%BSA or 5%FBS的1×PBS Fix Buffer：4%多聚甲醛的1×PBS 0.22μm濾器過(guò)濾 一抗：1h 二抗：30min |
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2樓2014-08-27 14:52:50
linshangyan
鐵蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 1.3
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- 紅花: 2
- 帖子: 192
- 在線: 126.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 246063
- 注冊(cè): 2006-04-29
- 專(zhuān)業(yè): 藥物分析
3樓2014-08-27 17:47:24
4樓2014-08-28 09:06:02
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