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zj251989新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
為何會(huì)有如此多的條帶？？？ 已有3人參與
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大家好，我最近正在做關(guān)于分子上的克隆，但是根據(jù)NCBI上設(shè)計(jì)的引物，因?yàn)楸磉_(dá)我要蛋白的基因有很多種，然后我就設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，老師給的菌沒(méi)有具體的種屬，然后提出基因組，PCR出如圖一樣的效果，我本身兩段目的片段是有1000bp左右，但是看著圖我凌亂了，不知道該怎么辦？求各位大神給給意見(jiàn)。。。。。。。 2000bp的marke 2000bp的marke |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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我個(gè)人認(rèn)為樓主的PCR 出現(xiàn)了涂帶和彌散帶。 PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策 凌波麗 2013年8月23日總結(jié)（第二次修訂，加上序號(hào)，使文章的層次清晰，另外修正了錯(cuò)漏之處） 2013年10月9日凌晨第三次修改補(bǔ)充。 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差或酶的專一性不夠，DNA模板量過(guò)大，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多，模板長(zhǎng)于3kb所引起。 其對(duì)策有： 1.減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點(diǎn)，分梯度上下調(diào)一調(diào)，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說(shuō)明書(shū)）；加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性或調(diào)換另一來(lái)源的專一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的專一性。 （1）改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素。可以加入反應(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過(guò)高，可以適當(dāng)加雙蒸餾水稀釋。 （3）為了加強(qiáng)Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應(yīng)體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。 3.適當(dāng)減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2+濃度同方向偶聯(lián)進(jìn)行，但是不必按同樣的比例。 4.適當(dāng)降低Mg2+濃 度，可以采用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2+的終濃度不要低于1.0mol/L。 5. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒(méi)有重新設(shè)計(jì)引物之前，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 7.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動(dòng)PCR和巢式PCR。使用熱啟動(dòng)模式。使用熱啟動(dòng)時(shí)可以購(gòu)買(mǎi)商用的PCR熱啟動(dòng)酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購(gòu)買(mǎi)。 8. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測(cè)一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 9.以上措施都不行時(shí)，最后就只能重新設(shè)計(jì)引物，加強(qiáng)引物的專一性。 10.適當(dāng)減少DNA模板量。 11.適當(dāng)減少循環(huán)次數(shù)，一般也就循環(huán)25次就差不多了。 12.如果樓主的PCR模板是3kb或者更大，用普通PCR效果大概不會(huì)很理想，應(yīng)該考慮使用Long-Range PCR。 |
8樓2014-08-20 12:01:40
2樓2014-08-19 16:40:23
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zj251989(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-19 20:24:13
zj251989: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-08-20 11:01:29
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zj251989(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-19 20:24:13
zj251989: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-08-20 11:01:29
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個(gè)人看法： 圖1的第一泳道是有主帶的，1000bp左右。你可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可能會(huì)減少些雜帶（PCR有雜帶也是挺正常的）。 不知道你的下一步實(shí)驗(yàn)是什么，如果是做克隆的話，那就切膠回收，連上載體測(cè)序，就知道是不是你想要的序列了。 |
3樓2014-08-19 16:40:58
zj251989
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4樓2014-08-20 11:01:18
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5樓2014-08-20 11:04:43
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