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林默淚

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[求助] NI柱純化后沒(méi)有酶活已有1人參與

我用的是PET28a，在BL21中表達(dá)，破碎上清測(cè)酶活是有的，過(guò)ni柱后，跑蛋白電泳，可以看出基本是目的蛋白，但是，酶活基本上可以說(shuō)是沒(méi)有。
求高手指點(diǎn)下~~

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1樓 2014-08-21 10:59:16

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林默淚

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引用回帖:

5樓: Originally posted by 君揚(yáng)1989 at 2014-08-22 09:53:09
請(qǐng)問(wèn) 我的蛋白表達(dá)量不是很高，您在表達(dá)蛋白時(shí)，所用的條件是如何的？還有，我的蛋白純化后，條帶不是單一的，這種情況如何處理？謝謝~

37度培養(yǎng)4小時(shí)后，IPTG（0.5mM）30度誘導(dǎo)9小時(shí)。
純化的時(shí)候，梯度洗脫測(cè)試下。然后每個(gè)梯度（50,100,200,250,300,400等）的樣跑個(gè)電泳。我是用5mM咪唑平衡，20咪唑可以洗下大部分雜蛋白，然后50mM咪唑再洗下剩下的大部分雜蛋白。然后200mM咪唑洗脫，這樣就差不多純了。不過(guò)我自己的柱子好像已經(jīng)不太好用了，吸附量不高，我用別人的用過(guò)，還是不錯(cuò)的。

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6樓2014-08-26 09:02:53

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zero19871029

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林默淚(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-21 15:33:22
林默淚: 金幣+3, ★★★很有幫助, 謝謝~~ 2014-08-22 08:08:40

我也遇到過(guò)這種問(wèn)題，原因很簡(jiǎn)單，就是鎳離子的毒害作用，洗脫蛋白的時(shí)候鎳離子也殘留在溶液中，要保持蛋白活性的話最好透析濃縮一下，另外羅氏再賣一款鎳柱是免毒害的，沒(méi)用過(guò)不知道好不好用

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2樓2014-08-21 14:34:03

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summerliehu

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請(qǐng)問(wèn)一下你破碎的上清是怎么測(cè)的酶活？

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3樓2014-08-21 14:42:53

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3樓: Originally posted by summerliehu at 2014-08-21 14:42:53
請(qǐng)問(wèn)一下你破碎的上清是怎么測(cè)的酶活？

與底物反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生丙酮酸，然后丙酮酸和2，4-二硝基苯肼反應(yīng)在堿性條件下會(huì)有棕紅色的產(chǎn)物，然后測(cè)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。

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4樓2014-08-22 08:12:30

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