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beaubear銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
microRNA實時定量PCR上游引物自身形成二聚物怎么辦？ 已有2人參與
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感覺自行設(shè)計PCR引物已經(jīng)很難了，何況RT-PCR要求更多；但碰上設(shè)計mir的RT-PCR引物，更是難上加難。。。 先吐槽一下，然后言歸正傳。 根據(jù)購買的試劑盒說明設(shè)計RT-PCR上游引物，直接將成熟miRNA序列中的U轉(zhuǎn)換成T，但首先Tm值不符合要求。于是對5‘端修飾，加入適當(dāng)GC，調(diào)整到合適Tm。采用PrimerSelect對引物進(jìn)行檢測，首先發(fā)現(xiàn)可能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，于是重新調(diào)整GC順序，直到ok。然后發(fā)現(xiàn)，所得引物最大的弊端是形成自身二聚體，這需要改變原miRNA序列，于是陷入混亂。。。 出現(xiàn)這種情況，那成熟miRNA在PCR擴(kuò)增時是不是也會自身形成二聚體？結(jié)果是否可靠，是偏大還是偏小呢？  求牛人解答~  |
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beaubear
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