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tuhua新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
擴(kuò)增不出產(chǎn)物 已有5人參與
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本人剛合成的引物正在做梯度PCR，目的條帶為1650bp,公司合成的單子顯示的上游引物為58.3，下游為58.9。用普通的aq酶沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)， 引物二聚體也沒(méi)有，所用的槍頭，管子都是剛滅菌的，cDNA沒(méi)有問(wèn)題，在超凈工作臺(tái)上操作。體系是20ul ，具體如下， Taq酶 0.3ul， 10*Buffer 2 ul， dNTP 1ul， cDNA 0.5ul， Mgcl2 1.2ul (25mM) 上游引物0.5 下游引物0.5 ddH2O 14ul 95 5min 95 30s 54/64 50s 72 100s 28個(gè)循環(huán) 72 10min 請(qǐng)各位幫忙分析下，是什么原因呢 |
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2樓2014-08-23 07:41:38
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
tuhua: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-09-07 18:48:34
tuhua: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-09-07 18:48:34
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1、這個(gè)最佳退火溫度就是58度左右，不需要梯度。 2、引物和器材應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題 3、模板用的cDNA，所以問(wèn)題也可能出在模板上，建議用內(nèi)參引物排除模板可能出現(xiàn)的問(wèn)題 4、酶也可能出現(xiàn)問(wèn)題，用的時(shí)間長(zhǎng)了效率也會(huì)降低的 5、再就是電泳，不知道Marker有沒(méi)有出來(lái) 6、你的循環(huán)次數(shù)是不是有點(diǎn)少，建議加到30——35個(gè)循環(huán) 以上個(gè)人見(jiàn)解，僅供參考 |
3樓2014-08-25 22:27:06
鬼羽帝魂
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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4樓2014-08-26 10:56:05
楊仔
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5樓2014-08-27 14:18:36
shizishanshang
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6樓2014-08-27 15:25:41
tuhua
新蟲(chóng) (小有名氣)
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7樓2014-09-07 18:58:34
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