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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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[求助] 分子克隆連接驗(yàn)證問題已有4人參與

最近把所克隆的目的基因連接到pET-28a載體上，轉(zhuǎn)化后挑菌用載體的通用引物驗(yàn)證不出來，但用特異性的引物能夠驗(yàn)證出目的基因，但測序時總是無信號，這個該怎么解？

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1樓 2014-09-09 12:32:38

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qapollo

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可以嘗試擴(kuò)增出目的基因后，PCR產(chǎn)物測序

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2樓2014-09-09 12:52:49

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huyan0817

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樓主測序的時候用的通用引物還是特異性引物???如果是通用引物那就正常了,你用通用引物沒有P出來，再測序也有問題，有可能是pET-28a載體有問題！樓主可以用雙酶切產(chǎn)物或則特異性引物的PCR產(chǎn)物去測序，如果正確說明你目的片斷連接上去了，但是你的載體有問題，那就只能從新弄個載體從新連接了！

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3樓2014-09-09 13:08:03

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bwangel

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引用回帖:

2樓: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 12:52:49
可以嘗試擴(kuò)增出目的基因后，PCR產(chǎn)物測序

這樣測序目的序列不全

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4樓2014-09-09 16:03:43

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bwangel

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【答案】應(yīng)助回帖

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載體的問題，是否把載體弄錯了？對應(yīng)載體的通用引物是肯定能擴(kuò)出來的

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5樓2014-09-09 16:05:07

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引用回帖:

2樓: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 12:52:49
可以嘗試擴(kuò)增出目的基因后，PCR產(chǎn)物測序

但是不能確定載體是否有問題

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6樓2014-09-09 20:53:33

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我覺得可能沒有連接上去，因?yàn)閱尉鰌cr本來就不準(zhǔn)確。特異性引物可能只是pcr出的游離片段。

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7樓2014-11-05 19:38:51

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反向測，如果正向沒信號

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8樓2014-11-05 21:05:10

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