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sunnjjian金蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR非常非常奇特的一個問題，尋高人解決菜鳥的困惑。 已有5人參與
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| 各位大神，我最近在做亞克隆，設計了好幾對引物，目的帶為711bp, 而PCR產(chǎn)物為1300bp左右，于是送去測序發(fā)現(xiàn)一個奇特的現(xiàn)象，1300bp中的兩小段正是我要的序列中的一部分，有一段還是反向互補的，除去這兩段序列將其他序列NCBI blast啥玩意也不是。也找不到我引物序列，請高人指點這是咋回事啊。 |
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sunnjjian
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2樓2014-09-24 20:27:47
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5樓2014-09-25 22:57:08
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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測序儀測序的時候，序列開頭的50bp左右是測不出來的，或者說開頭那段測出來可信度很低，一般都省略掉。正常情況下引物是不會出現(xiàn)在測序結(jié)果里的，目前的測序儀一般都用“邊合成邊測序”的原理測序，引物在反應前就已經(jīng)合成好了，根本測不出來。 目的片段長度是700多，實際擴增1300，這種情況一般都會認為引物特異性不好，不會送測序。測序結(jié)果出現(xiàn)的情況的確很奇特，要分析的話首先要看你做PCR用了什么模版，如果是質(zhì)粒模版，那擴增到blast比不出的序列也不算異常，也有可能是模版本身就有問題，PCR出來的片段本來就是這樣的。然后看看1300的片段里和你預想片段對應得上的兩個片段是不是連在一起的，還有它們的長度有多長，匹配程度是不是100%等等。再就是看測序公司了，也有可能是測序公司搞錯了。 |
7樓2014-09-26 12:11:11
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