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wendywan鐵桿木蟲 (小有名氣)
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[求助]
real time PCR 結(jié)果很詭異，求助高手啊�。。�
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最近一直做關(guān)于VEGF gene 的Real time PCR 試驗(yàn)，用的是roche 480跑的pcr。 詭異的地方在于： 1 第一次sample 濃度為50ng/ul,20ul體系上樣6ul，GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果顯示出來的CT值為9-10左右，組內(nèi)有人說GAPDH一般在13-15左右才會(huì)用，低于13都不會(huì)用。覺得我應(yīng)該稀釋模板。但是第一次改有的趨勢(shì)都正常。且BDNF作為陽性ctrl，也是正常的。 2 第二次用同樣的sample做。模板濃度稀釋為10ng/ul。上樣5ul。還是GAPDH作為內(nèi)參。這次的結(jié)果是GAPDH 的平均CT 值在14-16之間。結(jié)果目的基因出來的結(jié)果是該減少的全部增加了。不知道哪次的結(jié)果是正常的？ 想問的還有：一般在RNA提出來是測(cè)的濃度，作為矯正內(nèi)參的參考。之后在測(cè)cDNA濃度是否沒啥用處了，有人說在做反轉(zhuǎn)時(shí)加了dNTP后，會(huì)影響吸光值，所以cDNA的濃度壓根就不準(zhǔn)。是否是這樣的？ 為什么模板稀釋的濃度不一樣，會(huì)出現(xiàn)這么大的差異？像我這種情況，究竟哪次的結(jié)果比較準(zhǔn)確？ 期待大家的幫忙�。∽郊�。。。。。。。 |
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taccycle
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wendywan: 金幣+5 2013-10-17 13:01:06
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wendywan: 金幣+5 2013-10-17 13:01:06
| 相對(duì)定量一般都是反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候把RNA粗略定量一下就好了，cDNA不用定量的，不過反轉(zhuǎn)錄完一般確實(shí)是需要稀釋的，稀釋個(gè)5到10倍都可以，這個(gè)要看RNA濃度了，內(nèi)參的作用是在數(shù)據(jù)分析的時(shí)候用的，一般的Ct值落在15-30之間比較好，如果cDNA不稀釋確實(shí)會(huì)影響定量結(jié)果，但是一般不會(huì)有特別大的影響，，我覺得還是以稀釋后的定量結(jié)果為準(zhǔn)，至于你說結(jié)果不好的話是不是你把樣本放錯(cuò)了！！ |
2樓2013-10-17 12:12:42
wendywan
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謝謝！ 樣品應(yīng)該沒有放錯(cuò)！ RNA濃度測(cè)了之后，用的是M-MLV酶25ul反轉(zhuǎn)的。如果RNA濃度過大，會(huì)不會(huì)影響反轉(zhuǎn)效果？或者說cDNA中還殘余一部分沒反轉(zhuǎn)完全的RNA或者dNTP之類的，會(huì)后續(xù)影響PCR 的結(jié)果？ 我是在RNA濃度的基礎(chǔ)上稀釋成50ng/ul的，后來有稀釋成10ng/ul跑的第二次。 另外在請(qǐng)教一下： 熒光強(qiáng)度峰值出現(xiàn)在80-84度，應(yīng)該不會(huì)是二聚體吧？！一般認(rèn)為溫度在80以下出現(xiàn)峰值會(huì)認(rèn)為是二聚體？ |
3樓2013-10-17 13:00:34
taccycle
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4樓2013-10-17 13:07:19
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