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HX91926銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
麻煩問(wèn)一下實(shí)驗(yàn)室做表達(dá)經(jīng)常不成功是怎么回事 已有8人參與
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實(shí)驗(yàn)室做的都是基因克隆，轉(zhuǎn)化，然后表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室比較新，也不太有錢，大家所有的步驟都是一樣的，用的都是pet-28a（+）質(zhì)粒，剪切酶都是BamHⅠ、HindⅢ，都是導(dǎo)入到bl21（d3）中，表達(dá)都是用iptg誘導(dǎo)，但是據(jù)我所知，往屆的學(xué)姐學(xué)長(zhǎng)們，表達(dá)做出來(lái)的都很少，大部分都是做到轉(zhuǎn)化成功，然后做不出來(lái)，換題了。 現(xiàn)在我做自己的題也是，到轉(zhuǎn)化怎么也不成功，我們這一屆5個(gè)人，就一個(gè)人成功了，從轉(zhuǎn)化開始各種條件我感覺都做過(guò)了，就是看不到條帶 這是不是通病啊，問(wèn)題會(huì)不會(huì)出在構(gòu)建體系和轉(zhuǎn)化體系部分。好像我們老師并沒有換體系的意思啊，咋辦 |
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yonglu
銅蟲 (初入文壇)
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-10-16 11:15:24
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| 這個(gè)原因太多了。首先，要轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞之前，肯定是構(gòu)建含正確目標(biāo)序列的表達(dá)載體。怎么驗(yàn)證你的表達(dá)載體構(gòu)建正確了？酶切，測(cè)序，PCR擴(kuò)增等方法。這些都沒有問(wèn)題嗎？如果一切OK，那么就考慮是否是要轉(zhuǎn)化的細(xì)胞沒有處理好感受態(tài)，根本就沒轉(zhuǎn)進(jìn)去呢？轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)，相比也設(shè)置了，陰性對(duì)照（空的轉(zhuǎn)化細(xì)胞），陽(yáng)性對(duì)照（含空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)胞），以及含有你表達(dá)序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。三種同時(shí)培養(yǎng)，都有細(xì)胞篩選出來(lái)嗎？后期驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)然也是要陽(yáng)性對(duì)照和目的條帶一起PCR驗(yàn)證了。涉及到的操作步驟較多，試劑也多，建議還是要仔細(xì)審查每一步驟，確保每一步操作都正確吧。 |
3樓2014-10-14 11:23:05
2樓2014-10-14 10:34:39
lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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HX91926
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6樓2014-10-15 21:31:16
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7樓2014-10-15 21:38:24
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8樓2014-10-16 08:26:30
siriusxuan
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-10-16 11:15:43
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| 剛做過(guò)，表達(dá)很順利啊，不過(guò)內(nèi)切酶用的是BamH1和EcoR 1， IPTG 1mM ，26度誘導(dǎo)表達(dá)，得到的目的蛋白濃度很高。不過(guò)我在導(dǎo)入DE3之前先導(dǎo)入Top 10里面把質(zhì)粒擴(kuò)增之后，再提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3，這樣轉(zhuǎn)化效率稍微高一點(diǎn)。你把實(shí)驗(yàn)參數(shù)貼出來(lái)有問(wèn)題再說(shuō)吧。 |
9樓2014-10-16 09:21:55
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10樓2014-10-17 09:21:02
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