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[求助] 純化后蛋白中DNA污染檢測已有3人參與

求教下有什么方法可以檢測純化后的蛋白中是否含有DNA污染、污染程度如何呀？
求大神指點(diǎn)！謝謝啦！

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1樓 2014-10-15 17:15:55

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pennchem

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honeywanghe: 金幣+4, ★有幫助 2014-10-17 12:55:54

引用回帖:

4樓: Originally posted by honeywanghe at 2014-10-16 13:54:56
謝謝我做的是蛋白酶需要檢驗(yàn)純化后的蛋白酶是否有DNA污染因?yàn)榧兓^程中已經(jīng)盡量減少DNA的存在了現(xiàn)在的目的就是要在不影響酶活的前提下驗(yàn)證是否成功是否DNA污染足夠小以致可以忽略其對(duì)酶活性的影響。不 ...

我這里假設(shè)你用大腸桿菌作為宿主菌表達(dá)你的目的蛋白，那么純化中最大的污染源就是大腸桿菌的基因組DNA和質(zhì)粒DNA
所以選一個(gè)大腸桿菌的保守基因，做一個(gè)熒光定量，可以定量得出你的蛋白核酸含量。
然后這個(gè)濃度足夠低的情況下，應(yīng)該可以排除核酸對(duì)你的蛋白活性的影響。

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6樓2014-10-16 22:58:22

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pennchem

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個(gè)人意見，選一個(gè)宿主菌或細(xì)胞的保守基因，然后上熒光定量，如果低于某個(gè)數(shù)值，就可以認(rèn)為沒有了吧？

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2樓2014-10-15 17:24:11

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毛毛蟲123321

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honeywanghe(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-16 14:57:39

紫外分光光度計(jì)測A260 和A280 一般 A280/A260在1.5-2.0之間蛋白純度較高基本無核酸

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3樓2014-10-16 10:55:42

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2樓: Originally posted by pennchem at 2014-10-15 17:24:11
個(gè)人意見，選一個(gè)宿主菌或細(xì)胞的保守基因，然后上熒光定量，如果低于某個(gè)數(shù)值，就可以認(rèn)為沒有了吧？

謝謝我做的是蛋白酶需要檢驗(yàn)純化后的蛋白酶是否有DNA污染因?yàn)榧兓^程中已經(jīng)盡量減少DNA的存在了現(xiàn)在的目的就是要在不影響酶活的前提下驗(yàn)證是否成功是否DNA污染足夠小以致可以忽略其對(duì)酶活性的影響。不知可有什么好的建議期待您的解答！

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4樓2014-10-16 13:54:56

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3樓: Originally posted by 毛毛蟲123321 at 2014-10-16 10:55:42
紫外分光光度計(jì)測A260 和A280 一般 A280/A260在1.5-2.0之間蛋白純度較高基本無核酸

謝謝我目前的蛋白純度已經(jīng)很高了由于是蛋白酶因此要求更精確污染更小所以要檢測微量DNA的存在

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5樓2014-10-16 13:56:42

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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-17 15:52:56

純化的時(shí)候加過量的DNA酶和氯化鎂，充分降解DNA，經(jīng)過幾步純化后就不會(huì)有DNA了。
痕量、超痕量檢測很難，也沒有必要。前期工作做充分了，后來就不用擔(dān)心了。
希望對(duì)你有幫助！

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7樓2014-10-17 08:19:15

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6樓: Originally posted by pennchem at 2014-10-16 22:58:22
我這里假設(shè)你用大腸桿菌作為宿主菌表達(dá)你的目的蛋白，那么純化中最大的污染源就是大腸桿菌的基因組DNA和質(zhì)粒DNA
所以選一個(gè)大腸桿菌的保守基因，做一個(gè)熒光定量，可以定量得出你的蛋白核酸含量。
然后這個(gè)濃度足 ...

謝謝受用了不過這個(gè)濃度足夠低有木有相關(guān)文獻(xiàn)顯示低到什么程度可以排除核酸對(duì)蛋白活性的影響呀？

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8樓2014-10-17 12:55:47

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7樓: Originally posted by lihe131 at 2014-10-17 08:19:15
純化的時(shí)候加過量的DNA酶和氯化鎂，充分降解DNA，經(jīng)過幾步純化后就不會(huì)有DNA了。
痕量、超痕量檢測很難，也沒有必要。前期工作做充分了，后來就不用擔(dān)心了。
希望對(duì)你有幫助！

謝謝！不過我們現(xiàn)在的主要目的就是要檢測這個(gè)酶的污染情況需要得出定量的結(jié)果

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9樓2014-10-17 12:57:47

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8樓: Originally posted by honeywanghe at 2014-10-17 12:55:47
謝謝受用了不過這個(gè)濃度足夠低有木有相關(guān)文獻(xiàn)顯示低到什么程度可以排除核酸對(duì)蛋白活性的影響呀？...

這個(gè)，我的理解是，如果有標(biāo)準(zhǔn)，就按標(biāo)準(zhǔn)來，如果沒有，你自己就做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)出來。

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10樓2014-10-18 14:17:27

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