hajierlove

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[求助] 請大神幫忙分析引物設(shè)計的是否合理？已有4人參與

序列：
ATGGATGCTGATGCAGCTCTAGACCGGTGTGGAAAAGAGTTCAAAGTGGACATTTCCAGG
ATCAGCAGTTGTGCTGCCAGTGAGCACGGATCTGCTCTGCTGAAGAAACATGGAGACGAC
ACACACATCATAGAGCCCGGTTTCATTCCAACTATTATAGTAAATAATTCCAAAGACAAT
CAACCAGCTTTACTCAAAAACTTCCTCCTAGAAGTATATGACATAACAAATTGTGAGAAC
GGCGTGTTCAAGGACGACCAGAAGCTCAAGTGCTACATGTTCTGTCTGCTAGAGGAGGCC
AGTGTTGCTGATGAGAACGGCGTAGTAGACTACGAAATGATGATCAGCTTGATACCCGAG
GACTATACAGAAAGAGTTTCAAAAATGATAATGGCCTGCAAACATCTAGATACACCAGAT
AAGGATAAATGCCAAAGGGCGTTCGATGTTCATAAGTGTTCTTATGAAAAGGATCCAGAC
ATACTTACTGAGTACTAA
擴全長
F'ATGGATGCTGATGCAGC
R'GTACTCAGTAAGTATGTCTGGATCCTTT

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1樓 2014-11-10 17:02:10

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引用回帖:

5樓: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:58:17
退火溫度52度左右，做了梯度48-60，均沒有目的條帶，也做了touch down...

引物設(shè)計是沒問題的，可以適當(dāng)延長一下引物長度，提高一下Tm值，一般Tm值在60左右比較好

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6樓2014-11-11 20:43:23

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2014-11-12 11:22:07

似乎是可行的，具體可以看一下Tm值。你沒有設(shè)計酶切位點？

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2樓2014-11-11 17:16:49

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2樓: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 17:16:49
似乎是可行的，具體可以看一下Tm值。你沒有設(shè)計酶切位點？

首先，十分感動你幫我分析，有酶切位點，保護堿基，并且特異性對比，也沒有問題，但是pcr就是沒有目的片段，只有弱弱的引物二聚體，用的ex-taq酶，求指點

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踏實

3樓2014-11-11 18:17:29

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2014-11-12 11:22:11

引用回帖:

3樓: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:17:29
首先，十分感動你幫我分析，有酶切位點，保護堿基，并且特異性對比，也沒有問題，但是pcr就是沒有目的片段，只有弱弱的引物二聚體，用的ex-taq酶，求指點...

那應(yīng)該是復(fù)性溫度不合適，一般我們選擇Tm值低5℃作為復(fù)性溫度……溫度不合適就會有二聚體的，你可以試一個溫度梯度

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4樓2014-11-11 18:44:25

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4樓: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 18:44:25
那應(yīng)該是復(fù)性溫度不合適，一般我們選擇Tm值低5℃作為復(fù)性溫度……溫度不合適就會有二聚體的，你可以試一個溫度梯度...

退火溫度52度左右，做了梯度48-60，均沒有目的條帶，也做了touch down

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5樓2014-11-11 18:58:17

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6樓: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 20:43:23
引物設(shè)計是沒問題的，可以適當(dāng)延長一下引物長度，提高一下Tm值，一般Tm值在60左右比較好...

加上酶切位點，保護堿基，退火溫度就62了，不知它們算不算有效片段

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7樓2014-11-12 00:05:04

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我在擴全長的時候的引物tm不算酶切位點個保護堿基

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8樓2014-11-12 01:42:14

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沒看懂這個引物設(shè)計，酶切位點加在3端？這個是想擴出來干嘛的？

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9樓2014-11-12 07:47:31

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8樓: Originally posted by Pschanhui at 2014-11-12 01:42:14
我在擴全長的時候的引物tm不算酶切位點個保護堿基

我記得之前看過說酶切位點加保護堿基不屬于有效Tm值，可是，酶切位點和保護堿基也是你pcr出來的，不解？可否解釋一下

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10樓2014-11-12 09:03:19

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