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NanHao1991銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
PCR沒(méi)有條帶，求助 已有3人參與
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序列如下： atgtctttgaacgactttcaaaagcaacaaaagcaggccgctcccaaaccaaagaagactttgaagcttgtctccagttccggtatcaagttggccaatgctaccaagaaggttggcacaaaacctgccgaatctgataagaaagaggaagagaagtctgctgaaaccaaagaaccaactaaagagccaacaaaggtcgaagaaccagttaaaaaggaggagaaaccagtccagactgaagaaaagacggaggaaaaatcggaacttccaaaggtagaagaccttaaaatctctgaatcaacacataataccaacaatgccaatgttaccagtgctgatgccttgatcaaggaacaggaagaagaagtggatgacgaagttgttaacgatatgtttggtggtaaagatcacgtttctttaattttcatgggtcatgttgatgccggtaaatctactatgggtggtaatctactatacttgactggctctgtggataagagaactattgagaaatatgaaagagaagccaaggatgcaggcagacaaggttggtacttgtcatgggtcatggataccaacaaagaagaaagaaatgatggtaagactatcgaagttggtaaggcctactttgaaactgaaaaaaggcgttataccatattggatgctcctggtcataaaatgtacgtttccgagatgatcggtggtgcttctcaagctgatgttggtgttttggtcatttccgccagaaagggtgagtacgaaaccggttttgagagaggtggtcaaactcgtgaacacgccctattggccaagacccaaggtgttaataagatggttgtcgtcgtaaataagatggatgacccaaccgttaactggtctaaggaacgttacgaccaatgtgtgagtaatgtcagcaatttcttgagagcaattggttacaacattaagacagacgttgtatttatgccagtatccggctacagtggtgcaaatttgaaagatcacgtagatccaaaagaatgcccatggtacaccggcccaactctgttagaatatctggatacaatgaaccacgtcgaccgtcacatcaatgctccattcatgttgcctattgccgctaagatgaaggatctaggtaccatcgttgaaggtaaaattgaatccggtcatatcaaaaagggtcaatccaccctactgatgcctaacaaaaccgctgtggaaattcaaaatatttacaacgaaactgaaaatgaagttgatatggctatgtgtggtgagcaagttaaactaagaatcaaaggtgttgaagaagaagacatttcaccaggttttgtactaacatcgccaaagaaccctatcaagagtgttaccaagtttgtagctcaaattgctattgtagaattaaaatctatcatagcagccggtttttcatgtgttatgcatgttcatacagcaattgaagaggtacatattgttaagttattgcacaaattagaaaagggtaccaaccgtaagtcaaagaaaccacctgcttttgctaagaagggtatgaaggtcatcgctgttttagaaactgaagctccagtttgtgtggaaacttaccaagattaccctcaattaggtagattcactttgagagatcaaggtaccacaatagcaattggtaaaattgttaaaattgccgagtaatc 上游引物： aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctGAATTCatgtctttgaacgact 注：aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctGAATTC是添加的酶切位點(diǎn)和一段多肽； 下游引物： ggcggGAgctctTgattactcggc 該對(duì)引物怎么做都做不出來(lái)，試過(guò)各種條件，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是上游引物3’端有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 于是，將上游引物拆成F1和F2兩個(gè)引物，如下： F-1 tcaaacTCTAGAtctGAATTCatgtctttgaacgact F-2 aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctG 策略是: 1. 用F1和R擴(kuò)增出短序列（紅色）； 2. 用上步產(chǎn)物做模板，用F2和R擴(kuò)增出長(zhǎng)序列（藍(lán)色）。 目前卡在1了，死活擴(kuò)增不出短序列。跑膠結(jié)果顯示引物區(qū)域很亮，引物都在內(nèi)耗啊。。。 這是怎么回事啊，是引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題嗎？有沒(méi)有哪位能幫忙看下引物啊，雖然有些互補(bǔ)但都是必要序列沒(méi)辦法修改的。多謝多謝！ 圖片1.png |
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guoliwang
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