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swallow52u銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
PCR的電泳結(jié)果是除了Marker能出來(lái)?xiàng)l帶，其他都是什么都沒(méi)有
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我是做的RT-PCR做的細(xì)胞的，在提取完RNA后我做了電泳和濃度測(cè)定，結(jié)果都還不錯(cuò)。也順利的反轉(zhuǎn)錄成了CDNA，在做β-actin的PCR時(shí)，結(jié)果很好，條帶也比較清楚。我還做了兩遍，先是做了正常對(duì)照組的，接著跑了所有樣本的β-actin，所有樣都出來(lái)了，但我現(xiàn)在已經(jīng)重復(fù)不出來(lái)了，條件設(shè)置的都一樣！我也思考了下原因，可能是CDNA降解了？或者是引物污染了？我只能想到這么多�。空�(qǐng)各位高手幫幫我啊，我的實(shí)驗(yàn)該怎樣改進(jìn)？謝謝了？現(xiàn)在的PCR的電泳結(jié)果是除了Marker能出來(lái)?xiàng)l帶，其他都是什么都沒(méi)有。愁死我了啊！ 我的PCR體系是 PCR步驟: 20ul體系 MIX 10uL cDNA 1 uL 引物上游 1 uL， 引物下游 1 uL DEPC H2O 補(bǔ)足20ul 加樣的順序也是這樣的，不知道合適不？ PCR上機(jī)設(shè)置溫度: 處理 溫度 時(shí)間 預(yù)變性 94℃ 5min 變性 94℃ 30s 退火 根據(jù)說(shuō)明上下浮動(dòng)2℃ 45s 延伸 72℃ 30s 循環(huán) 35 從第2個(gè)開(kāi)始 45s/個(gè) 延伸 72 7min 4℃ Forever [ Last edited by 1949stone on 2011-5-20 at 17:59 ] |
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swallow52u
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我的PCR體系是 PCR步驟: 20ul體系 MIX 10uL cDNA 1 uL 引物上游 1 uL， 引物下游 1 uL DEPC H2O 補(bǔ)足20ul 加樣的順序也是這樣的，不知道合適不？ PCR上機(jī)設(shè)置溫度: 處理 溫度 時(shí)間 預(yù)變性 94℃ 5min 變性 94℃ 30s 退火 根據(jù)說(shuō)明上下浮動(dòng)2℃ 45s 延伸 72℃ 30s 循環(huán) 35 從第2個(gè)開(kāi)始 45s/個(gè) 延伸 72 7min 4℃ Forever |
2樓2011-05-20 01:55:39
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9樓2011-05-20 16:22:21
【答案】應(yīng)助回帖
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swallow52u(金幣+1): 2011-05-24 15:32:05
swallow52u(金幣+1): 2011-05-22 10:42:11
swallow52u(金幣+1): 2011-05-24 15:32:05
| MIX每次用的時(shí)候要混勻；加樣后也要混勻；模版降解是個(gè)問(wèn)題，每次吸取模板時(shí)稍微吹打下；引物方面降解可能性稍小點(diǎn)；每次加樣可以放冰上，嘗試下！反應(yīng)體系只要你以前出來(lái)過(guò)，應(yīng)該問(wèn)題不大，模版可以考慮重做，引物若有降解，在電泳時(shí)能看出來(lái)的��！ |
10樓2011-05-20 18:03:34
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