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95846713新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
蛋白表達(dá) 超聲破碎問(wèn)題 已有1人參與
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本人新手，不知道跑SDS-page時(shí)的上清和沉淀具體是哪個(gè)？ 用（1）（2）（3）（4）中哪2個(gè)跑SDS-page？ 超聲破碎后用不用離心啊？ 1. 上清：菌體誘導(dǎo)再離心后的上清（1）， 沉淀：菌體離心后沉淀， 再用PBS懸浮，再超聲波破碎（2） 2.菌體離心后，PBS重懸，超聲波破碎破碎，離心后的上清（3） 和沉淀（4） |
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youlinglyw
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【答案】應(yīng)助回帖
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95846713(myprayer代發(fā)): 金幣+5, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-19 11:34:20
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一般情況下 跑1 的目的是為了檢測(cè)你的蛋白是否除了包涵體外，還有可溶部分表達(dá)。如果可溶部分表達(dá)多的話，那么說(shuō)不定有活性或者需要收集。畢竟表達(dá)不易。不過(guò)大部分原核表達(dá)都是包涵體了，因?yàn)楸磉_(dá)速度快，再加上缺乏必要的酶去折疊修飾 跑2的目的，這個(gè)一般是用來(lái)和1做對(duì)比的。證明你的蛋白是在包涵體表達(dá)，而不是上清表達(dá)。 以上為一欄。可以并列跑，做對(duì)比。 跑3的目的是為了檢測(cè)你的包涵體在超聲破碎后已經(jīng)重新溶解在pbs中， 跑4的目的是為了檢測(cè)你的包涵體在超聲破碎后，依然沒(méi)有溶解在pbs中，那么你需要用尿素之類(lèi)的溶解過(guò)夜去把蛋白提取出來(lái)。 以上為一欄，可以并列跑，作對(duì)比，來(lái)防止有的蛋白非常容易溶解，你辛辛苦苦把包涵體拿出來(lái)，尿素溶解后，卻發(fā)現(xiàn)，沒(méi)東西，人家早就溶解到了上清了（這個(gè)比較罕見(jiàn)哈，也不排除，生物嘛，沒(méi)有例外還叫生物�。� 這4個(gè)都是有必要跑的。 其中1,2是必須跑得，用來(lái)最初證明包涵體表達(dá)。在發(fā)文章也會(huì)用到，而3,4則是用來(lái)做方便實(shí)驗(yàn)的。 因?yàn)榈鞍椎姆N類(lèi)多，條件也復(fù)雜。等電點(diǎn)等稍微的差異都會(huì)造成溶解不一樣。 如果非說(shuō)要跑的話，2,4是必須跑，事實(shí)上，1,2,4都是常見(jiàn)的。而很多人會(huì)選擇1,2,3,4都跑膠，這樣，證據(jù)鮮明，對(duì)照明顯，有說(shuō)服力。 |
2樓2014-11-19 10:16:39
youlinglyw
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【答案】應(yīng)助回帖
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補(bǔ)充說(shuō)明 之所以說(shuō)1,2是必須的，是因?yàn)槟阋嬖V對(duì)方、 a，我已經(jīng)成功進(jìn)行了蛋白表達(dá) b，我表達(dá)的蛋白大小是我需要的 c，我表達(dá)的蛋白其量是足夠我進(jìn)行下一步操作的，如果在1,2的電泳時(shí)候，你發(fā)現(xiàn)表達(dá)量不夠，那么后續(xù)根本沒(méi)必要做。必須優(yōu)化條件，換菌株，換載體，甚至換片段來(lái)獲取更高的表達(dá)量。蛋白的純化是非常損耗的，一般能得到20%左右都算很高很高了。 d，我表達(dá)的蛋白是存在于包涵體，因此，接下來(lái)可以毫無(wú)疑問(wèn)，我的蛋白是缺乏活性的。如果你要做的是有活性的蛋白，那么就要悠著點(diǎn)了，很多時(shí)候，用酵母表達(dá)，表達(dá)蛋白需存在于上清，才有活性。包涵體是沒(méi)活性的。 |
3樓2014-11-19 10:22:12
95846713
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4樓2014-11-19 10:27:06
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