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霍燁zz銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
腸道粘膜RNA提取總是降解，要崩潰了..... 已有3人參與
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想要做腸道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，做了兩批試驗(yàn)，結(jié)果腸道粘膜的RNA樣品都不合格 我把第二次的過(guò)程貼出來(lái)給大家看看，請(qǐng)指教到底有什么地方不合適： 1.樣品制備：將小腸樣品縱向剪開(kāi)，在預(yù)冷過(guò)的生理鹽水中漂洗幾次，用濾紙小心吸干，于冰上平皿內(nèi)刮取腸道粘膜，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中（提前加入0.5ml Trizol），直接放入-80冰箱保存； 2.RNA提取：樣品管加入0.5mlTrizol，使trizol總體積為1ml，漩渦混勻（是粘膜樣，就沒(méi)有用液氮磨）。加入200ul氯仿，混勻后12000轉(zhuǎn)離心15min 取上清，加入等體積異丙醇，混勻后-20℃放置20min；12000轉(zhuǎn)離心15min；去掉上清，用75%的酒精（DEPC水配制）洗滌沉淀兩次； RNA樣品晾干至半透明，用DEPC水溶解后-80℃保存 3.電泳鑒定： 用的是1%瓊脂糖+2ul golden view 3ul RNA + 3ul 2X RNA loading dye (65℃，變性10min） 然后120V，跑了20min，結(jié)果是這么個(gè)樣子：（上樣量5ul） Nanodrop結(jié)果： RNA電泳圖： 然后送公司鑒定的結(jié)果： 1是D-14，2是D-24 公司說(shuō)條帶比較模糊，彌散較多，說(shuō)明已經(jīng)降解了，不適合后續(xù)建庫(kù)測(cè)序......  師姐給我分析，可能是刮粘膜的過(guò)程太費(fèi)時(shí)間了，導(dǎo)致了降解，建議我可以直接取腸段提RNA 可是，我已經(jīng)很小心了，一直都是在冰上操作的，漂洗的生理鹽水也是4℃冰箱提前預(yù)冷過(guò)的，參考過(guò)很多文獻(xiàn)，涉及腸道上皮細(xì)胞的，一般都是采取刮粘膜的方式，為什么別人就能做出RNA來(lái)，而我卻不行�。�？？ 真誠(chéng)地求教各位，我這該怎么辦��？？ RNA都提不好，后面就沒(méi)法做了�。。。� 1.png |
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990104036
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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霍燁zz: 金幣+20, ★★★很有幫助, 謝謝！ 2015-01-22 10:38:24
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| 你為何保存樣品的時(shí)候就加入Trizol呢？我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常做腸道RNA。取樣的時(shí)候按你說(shuō)的方法洗干凈(其實(shí)也沒(méi)必要那么認(rèn)真，很多時(shí)候都是直接取腸斷，不刮粘膜)，取樣后放入試管中冷凍。當(dāng)開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，把樣品磨成粉末狀后與Trizol試劑。后面的過(guò)程都是那些就不說(shuō)了。整個(gè)過(guò)程中切記，在離心完成后取上清液一定小心，別把沉淀物取上來(lái)。 |
4樓2015-01-21 20:50:00
guoliwang
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 建議你把腸黏膜組織直接凍存送公司，讓他們自己提純、鑒定，然后建庫(kù)，也不會(huì)增加很多費(fèi)用。RNA如果發(fā)生降解，解決起來(lái)很麻煩。提純高質(zhì)量RNA對(duì)專(zhuān)門(mén)做這個(gè)的公司來(lái)說(shuō)就簡(jiǎn)單了。 |
2樓2014-12-07 18:55:11
霍燁zz
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3樓2014-12-07 23:10:37
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5樓2015-01-22 10:41:23
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