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霍燁zz銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
腸道粘膜RNA提取總是降解，要崩潰了..... 已有3人參與
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想要做腸道上皮細胞的轉錄組測序，做了兩批試驗，結果腸道粘膜的RNA樣品都不合格 我把第二次的過程貼出來給大家看看，請指教到底有什么地方不合適： 1.樣品制備：將小腸樣品縱向剪開，在預冷過的生理鹽水中漂洗幾次，用濾紙小心吸干，于冰上平皿內(nèi)刮取腸道粘膜，轉移至1.5ml離心管中（提前加入0.5ml Trizol），直接放入-80冰箱保存； 2.RNA提取：樣品管加入0.5mlTrizol，使trizol總體積為1ml，漩渦混勻（是粘膜樣，就沒有用液氮磨）。加入200ul氯仿，混勻后12000轉離心15min 取上清，加入等體積異丙醇，混勻后-20℃放置20min；12000轉離心15min；去掉上清，用75%的酒精（DEPC水配制）洗滌沉淀兩次； RNA樣品晾干至半透明，用DEPC水溶解后-80℃保存 3.電泳鑒定： 用的是1%瓊脂糖+2ul golden view 3ul RNA + 3ul 2X RNA loading dye (65℃，變性10min） 然后120V，跑了20min，結果是這么個樣子：（上樣量5ul） Nanodrop結果： RNA電泳圖： 然后送公司鑒定的結果： 1是D-14，2是D-24 公司說條帶比較模糊，彌散較多，說明已經(jīng)降解了，不適合后續(xù)建庫測序......  師姐給我分析，可能是刮粘膜的過程太費時間了，導致了降解，建議我可以直接取腸段提RNA 可是，我已經(jīng)很小心了，一直都是在冰上操作的，漂洗的生理鹽水也是4℃冰箱提前預冷過的，參考過很多文獻，涉及腸道上皮細胞的，一般都是采取刮粘膜的方式，為什么別人就能做出RNA來，而我卻不行啊？？？ 真誠地求教各位，我這該怎么辦��？？ RNA都提不好，后面就沒法做了�。。�！ 1.png |
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guoliwang
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4樓2015-01-21 20:50:00
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5樓2015-01-22 10:41:23
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7樓2016-10-03 09:53:48
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我也是最近開始提取小鼠盲腸前段上皮細胞的，因為小鼠太小了，刮取不到多少組織，請問大神我可不可以不刮取直接提取rna呢？（我的小鼠是20±2g的有用的部分還不到兩個指節(jié)那么長的，實在刮取不下多少的組織）還有一定要用生理鹽水沖洗嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-03-29 18:30:04
9樓2018-06-21 16:42:11
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