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趙小斯新蟲 (初入文壇)
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[求助]
植物RNA一直提不出來，是什么原因？ 已有2人參與
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雖然知道RNA很難提，但是沒想到這么難。瀏覽了小木蟲大部分關(guān)于提RNA的帖子，也用了其中很多經(jīng)驗(yàn)，但是還是提不出來。 我說一下實(shí)驗(yàn)過程，還望有經(jīng)驗(yàn)的朋友指導(dǎo)一番。 首先研磨是在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行的，之前研缽用DEPC水泡過一夜，離心管和槍頭都是買的無核酶的。 1、研缽預(yù)冷，在無核酶的離心管里先加入1ml trizol（trizol 用過全式金，羅氏，invitrogen，都沒提出來  ）2、加液氮研磨，期間會(huì)加液氮三到四次，磨到變成粉末，迅速加入到離心管中（植物組織保證<50mg），充分震蕩后靜置10min。 3、加入200ul氯仿，充分震蕩30s，靜置15min 4、12000r/m 4℃離心15min，取400ul上清于新的管子（保證不吸到中間層），加入 500ul異丙醇后顛倒混勻，靜置10min 5、12000r/m 4℃離心10min，去上清 6、加75%乙醇（DEPC水配置的），劇烈渦旋 7、12000r/m 4℃離心1min，去上清，再晾干 8、加30ulRNA溶解液。 測(cè)出來的A260/280有些是在2左右，但是一跑膠就變成彌散的帶。（跑膠槽是用的公用的） 但是大部分都在1.6左右。 心急，不知道原因出在何處，有沒有大神解答一下，不勝感激啊 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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趙小斯: 金幣+5, ★有幫助 2014-12-07 20:32:32
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趙小斯: 金幣+5, ★有幫助 2014-12-07 20:32:32
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說說我的經(jīng)驗(yàn)： 1. 為什么植物組織保證<50mg？我一般都是100mg左右，太少了，也不好提取的 2. 研磨是至關(guān)重要的。 研磨沒有必要在超凈臺(tái)中，但一定要在冰上。事先在冰山捶個(gè)小洞，差不多就是你研缽的大小。將預(yù)冷后的研缽放在洞上，加入液氮冷卻，直到保持研缽中的液氮不再外濺。 然后，放入植物組織，在有不少液氮的時(shí)候，輕輕將組織敲碎，或研磨碎。在液氮揮發(fā)的差不多的時(shí)候，快速研磨成粉末；這個(gè)時(shí)候，時(shí)間不宜太長(zhǎng)，如果覺得時(shí)間不夠，就再加點(diǎn)液氮（加的時(shí)候一定要注意，研缽溫度要低，不要把組織濺出來） 研磨好后，迅速將離心管中的 trizol倒入研缽中（要保證研缽溫度要低），邊倒邊用缽棒均開，保證 trizol均勻的覆蓋在粉末材料上。 以上過程一定要迅速再迅速。 這個(gè)時(shí)候，就可以把研缽放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上了，在 trizol融化的過程中，要及時(shí)將材料和覆蓋在材料上的 trizol混勻，這樣就會(huì)保證RNA不會(huì)被降解了。 |
2樓2014-12-07 20:14:49
趙小斯
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