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基因克隆與亞克隆 分離或合成外源基因 從基因組文庫中篩選 基因組DNA是指某種生物或細胞器或某個染色體基因組DNA即包括其所有的基因序列�；蚪M文庫，就是將上述基因組DNA用適當?shù)叵拗菩詢?nèi)切酶切成片段，與載體連接，重組DNA導入適當宿主細胞中增殖，獲得各DNA片斷地克隆，克隆數(shù)目應當包括某種生物、細胞器或某個染色體基因組所有的DNA片段即全部遺傳信息，這一組克隆總稱為基因組或基因文庫（genomic library）�；蚪M克隆片段不但包括編碼序列（外顯子），也含非編碼序列如內(nèi)含子及各種順式調(diào)節(jié)元件等。 從cDNA文庫中篩選 如果從某種生物細胞抽提總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄酶反應生成總cDNA，用構(gòu)建gDNA文庫相同的方法，可以構(gòu)建某種生物組織細胞的cDNA文庫，如人肝cDNA文庫、人腦cDNA文庫等。由cDNA文庫也可以篩選出所需的目的基因。cDNA文庫與gDNA文庫不同，它只有表達的轉(zhuǎn)錄體（包括RNA、蛋白質(zhì)或多肽的轉(zhuǎn)錄體）互補序列，不包括內(nèi)含子和其他不表達的DNA序列。 PCR擴增目的基因 建立gDNA文庫和cDNA文庫，從文庫中分離目的基因雖然有效，但步驟多、費時、篩選工作量大等困難，而且更重要的問題是往往不能獲得完整的全長基因。PCR技術(shù)可根據(jù)研究目的不同，既可以選擇以DNA為模板，通過擴增后得到含有包括內(nèi)含子和調(diào)控順序在內(nèi)的完整基因；又可選擇以RNA為起始材料，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增后得到無內(nèi)含子、無調(diào)控順序，只有結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄體的互補片斷。通過PCR擴增可獲得目的DNA或其中某一特定順序，用于亞克隆、酶切分析、建立cDNA文庫或作為探針。PCR技術(shù)的誕生，使基因克隆中操作變得更為快捷和準確。 目的基因與載體重組 特定靶基因插入載體DNA，經(jīng)DNA連接酶催化形成嵌合DNA。連接不同的DNA分子有很多方案可供選擇，需要根據(jù)具體情況綜合判斷而定。在設計基因亞克隆的方案是，最好采用電腦相應軟件程序進行設計，最佳連接方案是載體與靶DNA均具有兩個不同的互補粘性末端。如果載體與插入片斷末端缺乏互補的粘性末端，可以考慮用下列方法來解決：1，利用兩種或更多載體的多克隆位點，經(jīng)多次亞克隆，改變外源DNA片斷兩側(cè)的酶切位點，使其與載體的兩個不同粘性末端互補；2，利用人工接頭（linker或adaptor），在外源性DNA片斷或線性載體兩端形成粘性末端。 粘性末端連接法 全同源互補粘性末端 靶基因片斷和載體DNA，經(jīng)適當?shù)南嗤拗菩詢?nèi)切酶分別消化，使他們兩端各具有相同的粘性末端。在適宜溫度條件下，二者互補末端堿基配對，經(jīng)DNA連接酶作用，共價連接成新的重組DNA分子。這稱為全同源粘性末端連接。該法最簡單而且連接效率高，在克隆繁殖后，用同一限制酶消化，可回收插入DNA片斷。 做雙酶切時要注意以下幾點： 任何時候2種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積。 雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內(nèi)切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表(也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取)，如果有一種buffer能同時使2種酶的活力都超過70%的話，就可以用這種buffer作為反應buffer。如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。 如果2種酶的buffer成份相差較大或2種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查閱各種酶的反應溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關(guān)附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取。 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA片段再進行下次酶切，也可以在第一個酶切后直接用PCR產(chǎn)物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣（只需5分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eppendorf，S&S等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O，離心以洗去膜上殘留的雜質(zhì)，再加幾微升ddH2O在膜上，將柱子反轉(zhuǎn)插入新的eppendorf管上，離心，即可將DNA片段離下來，做下一次酶切。 特別注意：在雙酶切載體時如果2個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內(nèi)切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質(zhì)粒pLITMUS29的多克隆位點中BamH I旁邊有Hind III位點，如果先切BamH I再切Hind III 時就會出現(xiàn)Hind III切不動的情況，但是反過來就沒問題。更詳細的數(shù)據(jù)可參考相應的附錄，也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取。 雙酶切體系由于插入DNA片段與載體共4個末端全為粘性互補，所以外源基因插入可能有正反兩個方向；靶DNA/靶DNA，載體/載體，靶DNA/載體均可連接。在反應體系中，調(diào)整插入DNA片段與載體之間的濃度，將外源DNA片段濃度提高，使其與載體分子比以3：1為宜；另是用堿性磷酸酶將載體分子上5’-P切除。上述措施均可減少載體分子自身環(huán)化和串連。該方法的突出缺點是克隆的篩選費時。在構(gòu)建表達重組體時，插入DNA片段必需與上游啟動子的方向保持一致（均為5’-3’），否則導致閱讀框錯向，外源基因無法正確轉(zhuǎn)錄和翻譯表達或完全不表達。因此，構(gòu)建表達重組體需進行內(nèi)切酶切分析，鑒定插入DNA片段的方向。鑒定方法是：在插入位點相鄰的載體和插入DNA片段各選一個相同或不同的酶切位點，用內(nèi)切酶消化重組載體根據(jù)凝膠電泳的消化DNA片段長度，即可判斷是正向或反向插入。構(gòu)建表達載體一般都需要選擇定向克隆。 我們應用的雙酶切體系： 1) 在Tube管中加入下列反應液，全量為30μl DNA 1~2μg 10×Buffer 3μl 內(nèi)切酶1 0.75μl 內(nèi)切酶2 0.75μl 滅菌超純水 up to30μl 2) 37°C酶切4~5小時 3) DNA凝膠電泳，酶切回收。 非同源互補粘性末端 使外源DNA片段定向插入載體分子中的克隆方案叫定向克隆。定向克隆是將靶DNA片段和載體分別用兩個不同的限制性內(nèi)切酶切割，使兩種DNA片段自身的5’和3’粘性末端不同，但二者相同末端又互補，這明顯減少插入DNA片段和載體自身環(huán)化與串連，減低假陽性重組體的形成，使外源DNA片段能正向插入載體啟動子下游，這是成功表達外源基因的基本條件。定向克隆要求：線性載體DNA分子的兩個末端不能互補，或為兩種不同的粘性末端，或為粘性末端/一側(cè)為平端。前一種“粘-粘”形式經(jīng)兩種不同的內(nèi)切酶分別消化載體而產(chǎn)生，但這兩種酶不能是同裂解酶或能產(chǎn)生互補粘性末端的內(nèi)切酶�！罢�-粘”定向克隆效率非常高，是重組方案中最有效，最簡捷的途徑�！罢�-平”形式的末端有兩種途徑產(chǎn)生：用一個產(chǎn)生平端的內(nèi)切酶與一個產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶聯(lián)合消化DNA即產(chǎn)生；或用兩個產(chǎn)生不同粘性末端的內(nèi)切酶消化，使載體與靶DNA的一個末端互補，連接后再將另一個不互補的粘性末端用Smal或綠豆 |
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2樓2011-03-23 15:09:45
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