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基因克隆與亞克隆 分離或合成外源基因 從基因組文庫(kù)中篩選 基因組DNA是指某種生物或細(xì)胞器或某個(gè)染色體基因組DNA即包括其所有的基因序列�；蚪M文庫(kù)，就是將上述基因組DNA用適當(dāng)?shù)叵拗菩詢?nèi)切酶切成片段，與載體連接，重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞中增殖，獲得各DNA片斷地克隆，克隆數(shù)目應(yīng)當(dāng)包括某種生物、細(xì)胞器或某個(gè)染色體基因組所有的DNA片段即全部遺傳信息，這一組克隆總稱為基因組或基因文庫(kù)（genomic library）�；蚪M克隆片段不但包括編碼序列（外顯子），也含非編碼序列如內(nèi)含子及各種順式調(diào)節(jié)元件等。 從cDNA文庫(kù)中篩選 如果從某種生物細(xì)胞抽提總RNA，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)生成總cDNA，用構(gòu)建gDNA文庫(kù)相同的方法，可以構(gòu)建某種生物組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，如人肝cDNA文庫(kù)、人腦cDNA文庫(kù)等。由cDNA文庫(kù)也可以篩選出所需的目的基因。cDNA文庫(kù)與gDNA文庫(kù)不同，它只有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄體（包括RNA、蛋白質(zhì)或多肽的轉(zhuǎn)錄體）互補(bǔ)序列，不包括內(nèi)含子和其他不表達(dá)的DNA序列。 PCR擴(kuò)增目的基因 建立gDNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，從文庫(kù)中分離目的基因雖然有效，但步驟多、費(fèi)時(shí)、篩選工作量大等困難，而且更重要的問(wèn)題是往往不能獲得完整的全長(zhǎng)基因。PCR技術(shù)可根據(jù)研究目的不同，既可以選擇以DNA為模板，通過(guò)擴(kuò)增后得到含有包括內(nèi)含子和調(diào)控順序在內(nèi)的完整基因；又可選擇以RNA為起始材料，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增后得到無(wú)內(nèi)含子、無(wú)調(diào)控順序，只有結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄體的互補(bǔ)片斷。通過(guò)PCR擴(kuò)增可獲得目的DNA或其中某一特定順序，用于亞克隆、酶切分析、建立cDNA文庫(kù)或作為探針。PCR技術(shù)的誕生，使基因克隆中操作變得更為快捷和準(zhǔn)確。 目的基因與載體重組 特定靶基因插入載體DNA，經(jīng)DNA連接酶催化形成嵌合DNA。連接不同的DNA分子有很多方案可供選擇，需要根據(jù)具體情況綜合判斷而定。在設(shè)計(jì)基因亞克隆的方案是，最好采用電腦相應(yīng)軟件程序進(jìn)行設(shè)計(jì)，最佳連接方案是載體與靶DNA均具有兩個(gè)不同的互補(bǔ)粘性末端。如果載體與插入片斷末端缺乏互補(bǔ)的粘性末端，可以考慮用下列方法來(lái)解決：1，利用兩種或更多載體的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)多次亞克隆，改變外源DNA片斷兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，使其與載體的兩個(gè)不同粘性末端互補(bǔ)；2，利用人工接頭（linker或adaptor），在外源性DNA片斷或線性載體兩端形成粘性末端。 粘性末端連接法 全同源互補(bǔ)粘性末端 靶基因片斷和載體DNA，經(jīng)適當(dāng)?shù)南嗤拗菩詢?nèi)切酶分別消化，使他們兩端各具有相同的粘性末端。在適宜溫度條件下，二者互補(bǔ)末端堿基配對(duì)，經(jīng)DNA連接酶作用，共價(jià)連接成新的重組DNA分子。這稱為全同源粘性末端連接。該法最簡(jiǎn)單而且連接效率高，在克隆繁殖后，用同一限制酶消化，可回收插入DNA片斷。 做雙酶切時(shí)要注意以下幾點(diǎn)： 任何時(shí)候2種酶的總量不能超過(guò)反應(yīng)體系的1/10體積。 雙酶切時(shí)如果兩種酶反應(yīng)溫度一致而buffer不同時(shí)，可查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表(也可以向ebiotrade.com客戶服務(wù)部索取)，如果有一種buffer能同時(shí)使2種酶的活力都超過(guò)70%的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer。如果兩種酶廠家不同無(wú)法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。 如果2種酶的buffer成份相差較大或2種酶的反應(yīng)溫度不同則必須分別做酶切。第1種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進(jìn)行下一次酶切反應(yīng)。廠家目錄一般都會(huì)有相應(yīng)的附錄以供查閱各種酶的反應(yīng)溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關(guān)附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務(wù)部索取。 第一次酶切后通過(guò)電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA片段再進(jìn)行下次酶切，也可以在第一個(gè)酶切后直接用PCR產(chǎn)物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣（只需5分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進(jìn)行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eppendorf，S&S等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過(guò)濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O，離心以洗去膜上殘留的雜質(zhì)，再加幾微升ddH2O在膜上，將柱子反轉(zhuǎn)插入新的eppendorf管上，離心，即可將DNA片段離下來(lái)，做下一次酶切。 特別注意：在雙酶切載體時(shí)如果2個(gè)酶切位點(diǎn)靠得很近，必須注意酶切順序。因?yàn)橛械南拗菩詢?nèi)切酶要求其識(shí)別序列的兩端至少保留有若干個(gè)堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識(shí)別序列兩端有多個(gè)堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質(zhì)粒pLITMUS29的多克隆位點(diǎn)中BamH I旁邊有Hind III位點(diǎn)，如果先切BamH I再切Hind III 時(shí)就會(huì)出現(xiàn)Hind III切不動(dòng)的情況，但是反過(guò)來(lái)就沒(méi)問(wèn)題。更詳細(xì)的數(shù)據(jù)可參考相應(yīng)的附錄，也可以向ebiotrade.com客戶服務(wù)部索取。 雙酶切體系由于插入DNA片段與載體共4個(gè)末端全為粘性互補(bǔ)，所以外源基因插入可能有正反兩個(gè)方向；靶DNA/靶DNA，載體/載體，靶DNA/載體均可連接。在反應(yīng)體系中，調(diào)整插入DNA片段與載體之間的濃度，將外源DNA片段濃度提高，使其與載體分子比以3：1為宜；另是用堿性磷酸酶將載體分子上5’-P切除。上述措施均可減少載體分子自身環(huán)化和串連。該方法的突出缺點(diǎn)是克隆的篩選費(fèi)時(shí)。在構(gòu)建表達(dá)重組體時(shí)，插入DNA片段必需與上游啟動(dòng)子的方向保持一致（均為5’-3’），否則導(dǎo)致閱讀框錯(cuò)向，外源基因無(wú)法正確轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)或完全不表達(dá)。因此，構(gòu)建表達(dá)重組體需進(jìn)行內(nèi)切酶切分析，鑒定插入DNA片段的方向。鑒定方法是：在插入位點(diǎn)相鄰的載體和插入DNA片段各選一個(gè)相同或不同的酶切位點(diǎn)，用內(nèi)切酶消化重組載體根據(jù)凝膠電泳的消化DNA片段長(zhǎng)度，即可判斷是正向或反向插入。構(gòu)建表達(dá)載體一般都需要選擇定向克隆。 我們應(yīng)用的雙酶切體系： 1) 在Tube管中加入下列反應(yīng)液，全量為30μl DNA 1~2μg 10×Buffer 3μl 內(nèi)切酶1 0.75μl 內(nèi)切酶2 0.75μl 滅菌超純水 up to30μl 2) 37°C酶切4~5小時(shí) 3) DNA凝膠電泳，酶切回收。 非同源互補(bǔ)粘性末端 使外源DNA片段定向插入載體分子中的克隆方案叫定向克隆。定向克隆是將靶DNA片段和載體分別用兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶切割，使兩種DNA片段自身的5’和3’粘性末端不同，但二者相同末端又互補(bǔ)，這明顯減少插入DNA片段和載體自身環(huán)化與串連，減低假陽(yáng)性重組體的形成，使外源DNA片段能正向插入載體啟動(dòng)子下游，這是成功表達(dá)外源基因的基本條件。定向克隆要求：線性載體DNA分子的兩個(gè)末端不能互補(bǔ)，或?yàn)閮煞N不同的粘性末端，或?yàn)檎承阅┒?一側(cè)為平端。前一種“粘-粘”形式經(jīng)兩種不同的內(nèi)切酶分別消化載體而產(chǎn)生，但這兩種酶不能是同裂解酶或能產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端的內(nèi)切酶。“粘-粘”定向克隆效率非常高，是重組方案中最有效，最簡(jiǎn)捷的途徑�！罢�-平”形式的末端有兩種途徑產(chǎn)生：用一個(gè)產(chǎn)生平端的內(nèi)切酶與一個(gè)產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶聯(lián)合消化DNA即產(chǎn)生；或用兩個(gè)產(chǎn)生不同粘性末端的內(nèi)切酶消化，使載體與靶DNA的一個(gè)末端互補(bǔ)，連接后再將另一個(gè)不互補(bǔ)的粘性末端用Smal或綠豆 |
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2樓2011-03-23 15:09:45
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