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孤鴻飄渺影新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助！小載體連大片段怎么連，求高手指點(diǎn)！
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| 我一個(gè)4.2k的載體連接一個(gè)7k的片段，試了好幾把都沒(méi)連上。酶切位點(diǎn)是BspEⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。請(qǐng)各位高手支點(diǎn)招！多謝！ |
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2樓2014-12-16 01:26:04
gangouyang
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3樓2014-12-16 14:29:14
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4樓2014-12-16 14:48:19
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孤鴻飄渺影: 金幣+60, ★★★很有幫助, 多謝您的建議，我已經(jīng)連上了。是將7k的片段分兩部分連上的。 2015-01-29 15:20:07
孤鴻飄渺影: 金幣+60, ★★★很有幫助, 多謝您的建議，我已經(jīng)連上了。是將7k的片段分兩部分連上的。 2015-01-29 15:20:07
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聽(tīng)你說(shuō)的，初步判斷你的情況是：載體沒(méi)切干凈，載體自連。順便說(shuō)一句：挑6個(gè)clone鑒定，如果沒(méi)有陽(yáng)性的話，就重來(lái)再切一次載體，最多挑10個(gè)。另外，你賞的10金幣有點(diǎn)少，如果按照以下分析問(wèn)題得以解決的話，至少20金幣。 解決方案： 1.首先確定你的酶切位點(diǎn)所用的兩個(gè)酶在載體上是不是靠得太近了，甚至有共用堿基的情況，如果是，請(qǐng)換酶切位點(diǎn)，因?yàn)槟悴豢赡苣玫诫p切的空載體。如果你非要用這兩個(gè)酶，辦法也是有的，就不贅述了。 2.如果不是1這種情況，那么建議你重新切載體，先用HindIII切，膠回收后，再用BspEⅠ切，再膠回收，請(qǐng)勿做同時(shí)雙酶切，因?yàn)镠indIII在buffer2中活性是100%，在其他的buffer中活性不高，BspEⅠ在buffer3活性中是100%，在其他的buffer中活性不高。 3.按照以下說(shuō)明操作：把載體當(dāng)插入片段，把插入片段當(dāng)載體，連接時(shí)間加長(zhǎng)，建議用NEB的連接酶，效率高一些。 祝你賞我金幣，謝謝！ |
5樓2014-12-17 18:16:29
孤鴻飄渺影
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6樓2014-12-19 18:16:29
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