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陳彥利鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
西紅柿果肉RNA提取，降解嚴(yán)重 已有10人參與
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第一次提RNA，最近提西紅柿果肉RNA，降解很嚴(yán)重（見圖）。西紅柿果肉在液氮中不好研磨，所以我直接在裂解液里研磨的，大概2~3g西紅柿加3 mTRNzol試劑研磨（樣品量是不是大了？），用的是天根的TRNzol 總 RNA 提取試劑盒，電泳用1%瓊脂糖電泳，90V，電泳20min。上樣時，好幾次都是樣品都飄起來，沉不下去，是不是乙醇揮發(fā)不徹底？請老師們同學(xué)們幫忙分析一下。提了很多次都這樣，快崩潰了...求過來人指導(dǎo)！ 20141215_095059.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1.你的樣品加入太多了，一般試劑盒只需要50mg-100mg樣品即可，太多的話內(nèi)源性的RNase太多，Trizol里的抑制劑抑制效果不完全。 2.你的電泳時間太久了，難免會分解嚴(yán)重。再次重復(fù)下試試，將電泳緩沖液TAE重新?lián)Q制，電壓調(diào)高(150V)，時間縮短（10-15min），只要能區(qū)分去三條帶即可。 3.確保提取過程中操作嚴(yán)格，保持空氣不要流動，離心機(jī)全程4℃。 4.你說的上樣時會飄起來？是不是沒有用Loading Buffer染色？不會是酒精沒揮發(fā)完全，可以測量純度（OD260/230）來觀察，有酒精殘留時候會有亂峰，參考乙醇的峰型。 希望對你有用，祝你實(shí)驗(yàn)順利。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
陳彥利18樓2014-12-16 16:28:36
chriscda
木蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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一般性地，建議你注意這些事項(xiàng)：1. TRIzol一般需要達(dá)到樣品的10倍體積；2. 全程使用RNase-free的耗材、試劑（包括水）和新鮮的電泳緩沖液； 3. 在5-10分鐘內(nèi)完成電泳。 不過，具體到你的實(shí)驗(yàn)，我覺得不像是發(fā)生嚴(yán)重降解，或者說我沒覺得有降解�？赡苁荝NA載樣過多，染料（可能你用的EB，其他的也差不多）被小分子量的RNA吸附得差不多了，大分子量的18S和28S就會變暗。發(fā)生降解是你會觀察到各個條帶分子量都有變小，跑出彌散的結(jié)果。 |
35樓2014-12-18 17:21:03
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陳彥利(金幣+1): 謝謝參與
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， [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
2樓2014-12-15 15:51:43
★
陳彥利(金幣+1): 謝謝參與
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3樓2014-12-15 15:55:44
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陳彥利(金幣+1): 謝謝參與
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4樓2014-12-15 15:58:09
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陳彥利(金幣+1): 謝謝參與
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5樓2014-12-15 16:16:50
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
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6樓2014-12-15 16:48:56
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7樓2014-12-15 17:56:03
myyounger
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- 專業(yè): 腦血管結(jié)構(gòu)、功能異常及相
8樓2014-12-15 18:08:19
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9樓2014-12-15 19:10:42
| 祝福祝福發(fā)祝福 |
10樓2014-12-15 19:57:08
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