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95846713新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET28a 轉(zhuǎn)化后不長菌 換pet32a 需要什么注意事項？ 已有1人參與
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最近構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段膠回收產(chǎn)物與pet28a 用Bamh I 和Hind III雙酶切后 經(jīng)T4 DNA ligase 連接 轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，涂卡納抗性平板，發(fā)現(xiàn)不長菌��？聽別人說pet28a長得慢是這樣嗎？ 雙酶切體系：膠回收產(chǎn)物12 ul ，Bamh I 0.75ul，Hind III 0.75ul， 10×Butter K 1.5ul 總計 15ul pet28a 6ul ，dd 水 2ul ，Bamh I 0.5 ul，Hind III 0.5ul ， 10×Butter K 1 ul，總計 10ul 將雙酶切后的產(chǎn)物與per28a跑電泳，與未酶切的對比（確實切下來了），切膠回收，進行16℃過夜連接 連接體系：雙酶切后的膠回收產(chǎn)物9ul， 雙酶切后pet28a 3ul，T4 DNA Ligase 1.5 ul，10×T4 Butter 1.5 ul ，總計15ul 不知道這樣的體系有沒有問題？ 另外看論壇上有人說連接pet28a熱擊36秒即可，我熱擊的是60秒，有影響嗎？ 引物設(shè)計的酶切 位點是Bamh I和Hind III， pet32a上也有這兩個，我如果用換載體pet32a 需要注意什么呢？ 啟動子方面注意什么？ |
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lihe131
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4樓2017-12-06 13:28:45
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