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95846713

新蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] PET28a 轉(zhuǎn)化后不長(zhǎng)菌換pet32a 需要什么注意事項(xiàng)？已有1人參與

最近構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段膠回收產(chǎn)物與pet28a 用Bamh I 和Hind III雙酶切后  經(jīng)T4 DNA ligase 連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂卡納抗性平板，發(fā)現(xiàn)不長(zhǎng)菌�。柯�(tīng)別人說(shuō)pet28a長(zhǎng)得慢是這樣嗎？
雙酶切體系：膠回收產(chǎn)物12 ul ，Bamh I 0.75ul，Hind III 0.75ul， 10×Butter K 1.5ul 總計(jì)  15ul
                  pet28a  6ul ，dd 水 2ul  ，Bamh I 0.5 ul，Hind III 0.5ul ， 10×Butter K 1 ul，總計(jì) 10ul
將雙酶切后的產(chǎn)物與per28a跑電泳，與未酶切的對(duì)比（確實(shí)切下來(lái)了），切膠回收，進(jìn)行16℃過(guò)夜連接
連接體系：雙酶切后的膠回收產(chǎn)物9ul，雙酶切后pet28a 3ul，T4 DNA Ligase 1.5 ul，10×T4 Butter 1.5 ul ，總計(jì)15ul
不知道這樣的體系有沒(méi)有問(wèn)題？  另外看論壇上有人說(shuō)連接pet28a熱擊36秒即可，我熱擊的是60秒，有影響嗎？

引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)是Bamh I和Hind III， pet32a上也有這兩個(gè)，我如果用換載體pet32a 需要注意什么呢？啟動(dòng)子方面注意什么？

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1樓 2014-12-23 11:09:22

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橙橙小沫

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樓主問(wèn)題解決了嗎？為什么轉(zhuǎn)化后在卡納抗性平板不容易長(zhǎng)出來(lái)呢？我也遇到了同樣的問(wèn)題

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4樓2017-12-06 13:28:45

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lihe131

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95846713(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-12-23 19:09:13
95846713: 金幣+9 2014-12-30 18:39:54

熱激時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，是不是菌都燙死了？
還有熱激完需要用無(wú)抗培養(yǎng)基復(fù)蘇，這個(gè)別忘了。
最后就是卡納霉素比較厲害，我之前這種情況都是在平板中用正常濃度的1/3或1/4。
祝成功！

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2樓2014-12-23 16:14:03

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湖南戴鵬輝

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我和你的情況是一樣的，做了很久的蛋白質(zhì)原核表達(dá)也沒(méi)有結(jié)果。連接后轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞我用的是42攝氏度熱激90秒。我也想換載體了，但是必須要換一個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRI，所以我重新設(shè)計(jì) 了一下引物，接下來(lái)怎么做你知道嗎？

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好好生活，好好工作

3樓2015-08-15 11:10:30

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