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xcs100: 金幣+7 2014-12-30 12:43:28
重組蛋白質(zhì)的分離純化是否存在一般順序
凌波麗
2014年12月30日
結(jié)合我個人和別人的工作經(jīng)驗，敘述如下（不一定都正確）:
蛋白質(zhì)的分離提純由于不同的蛋白質(zhì)的彼此差異較大，就普遍而言可能沒有特定的分離純化的固定順序，不過仍然有一些可以參考的大致的分離純化流程。因為我的實驗工作是與重組蛋白質(zhì)相關(guān)，所以就在這里討論重組蛋白分離純化的可作參考的大致的分離純化流程。一般來說，重組蛋白質(zhì)的分離純化比天然蛋白質(zhì)要容易一些。
一般蛋白質(zhì)的分離純化的一般順序是：粉碎細胞或提取含有提取分泌到細胞外的表達產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）、中間純化操作、最后采用高分辨率的純化方法進行分離純化、產(chǎn)物鑒定和保存。
第一步，粗分離。粉碎細胞或提取含有提取分泌到細胞外的表達產(chǎn)物的培養(yǎng)基、沉淀、過濾、初步濃縮（比如超濾）一般也叫粗分離。與天然蛋白質(zhì)的分離純化相比，重組蛋白質(zhì)的分離純化可以不用先去確定足量表達目的蛋白質(zhì)的組織與細胞，并且先對這些組織和細胞進行分離和富集，另外由于大腸桿菌表達系統(tǒng)的廣泛使用，重組蛋白質(zhì)往往在大腸桿菌細胞中形成包涵體，如果不用分泌表達的話，這樣粉碎了大腸桿菌細胞后只要過濾就可以獲得固體的包涵體顆粒。即使要使用酵母細胞、動物細胞和植物細胞表達重組蛋白也往往需要先在大腸桿菌細胞等原核細胞中進行試表達。如果不形成包涵體時，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀可使用、丙酮、硫酸銨、聚乙烯亞酰胺等化學(xué)試劑或者調(diào)節(jié)溶液的pH值至目的蛋白質(zhì)的等電點獲得沉淀并經(jīng)過過濾而取出，然后在對沉淀物進行溶解，如果是耐高溫的目的蛋白質(zhì)可以通過加熱使得其他蛋白質(zhì)變性后沉淀，然后提取和保留上清液，上清液里即含有目的蛋白質(zhì)。包涵體經(jīng)過離心、沉淀、過濾獲得后，也必須使得包涵體溶解，否則后面的分離提純工作就無法進行了。不易溶解于水的蛋白質(zhì)可使用去垢劑或表面活性劑增溶 以便達到蛋白質(zhì)溶解于水的目的，但是不要使用超聲波把渾濁的蛋白質(zhì)溶液“絞”成清亮狀態(tài)，因為超聲波的能量足以打斷共價鍵，使得肽鏈斷裂。不幸的是：一些實驗操作者對于超聲波發(fā)生器似乎有過于強烈的實驗需求，可能是因為操作省事，反正強度適當且時間足夠，開動超聲波發(fā)生器肯定是能把渾濁的蛋白質(zhì)溶液“絞”成清亮狀態(tài)，超聲波連帶有肽聚糖細胞壁的大腸桿菌細胞都能粉碎，何況溶液中的蛋白質(zhì)。簡而言之，利用蛋白質(zhì)的溶解度和抗熱性與抗蛋白酶解等特殊性質(zhì)分離出蛋白質(zhì)一般是在第一步的粗分離階段，而不在中間純化和精細分離這兩個步驟進行，粗分離過程也利用蛋白質(zhì)的密度、分子量大小和形狀的特性，蛋白質(zhì)的后三種性質(zhì)在后面的中間純化和精細分離同樣會利用到。利用蛋白質(zhì)的溶解度與抗蛋白酶解等特殊性質(zhì)有時候在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的質(zhì)量檢測階段也可能用到。粗分離階段已經(jīng)能夠去掉相當多的DNA、多糖、脂類、熱源、病毒等非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分，但是以后的分離純化蛋白質(zhì)的技術(shù)環(huán)節(jié)仍然必須考慮到去除非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分。
第二步，中間純化。中間純化階段一般是利用蛋白質(zhì)的分子量、形狀、電荷性質(zhì)、等電點、疏水性、密度、與配體的結(jié)合能力、與金屬的結(jié)合能力、與有機小分子（比如某些、染料分子）的結(jié)合能力等特性進行蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離提純。中間純化的實驗操作普遍地包括各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、金屬螯合層析、等電點聚焦、凝膠過濾層析等，也包括離心、透析、超濾等其他操作穿插其間，不過一般沒有電泳，特別是在大規(guī)模分離提純蛋白質(zhì)時。各種層析方法，比如離子交換層析、疏水層析、親和層析、等電點聚焦、凝膠過濾層析、金屬螯合層析等在中間分離純化階段沒有完全固定的順序，雖然一般處理比較大量的樣品時，離子交換層析、疏水層析一般先使用，但是有時在凝膠層析之后也可能會用到離子交換層析、疏水層析，比較普遍的情況而言，親和層析、金屬螯合層析不會首先在中間分離階段的初始時期及使用。
一個離子交換層析介質(zhì)，無論是陰離子交換柱，還是陽離子交換柱，反正因為蛋白質(zhì)A的pI=5.0小于緩沖溶液的pH=7.0,而會帶上負電荷， 蛋白質(zhì)B的pI=9.0大于緩沖溶液的pH=7.0，而會帶上正電荷，所以必有其一會粘在離子交換層析柱上。具體一些說，因為蛋白質(zhì)A的pI=5.0小于緩沖溶液的pH=7.0,而會帶上負電荷，就會和陰離子交換層析柱結(jié)合，比如氨乙基、季胺基、二乙基氨乙基等離子交換層析；蛋白質(zhì)B的pI=9.0大于緩沖溶液的pH=7.0而凈帶上正電荷，而與陽離子交換層析柱相結(jié)合，比如：羧甲基、磺丙基、磷酸基、磺甲基等的離子交換層析柱結(jié)合。上樣后，帶流出穿透峰（穿透峰不帶有蛋白質(zhì)，面積大，峰寬，且不在280nm處，很容易辨認）之后，無論哪種蛋白質(zhì)黏在柱上，根據(jù)上樣液流出的有UV280信號的收集峰的蛋白質(zhì)必須要收集，而且流出的收集液里必然是另一種蛋白質(zhì)；然后用稍大一些的離子濃度的緩沖溶液再淋洗數(shù)次層析柱，這時的收集液也基本上是不掛柱的那種蛋白質(zhì)居多；等到UV280響應(yīng)信號重新回到基線后，用濃度最大的緩沖溶液，比如pH=7.0的20mM Tris-HCl緩沖溶液（含500mM NaCl）進行洗脫，此時要換個收集瓶收集第二種蛋白質(zhì)。
至少在我的工作經(jīng)驗，電泳較少用于過中間分離階段，電泳是用于蛋白質(zhì)的純度檢驗階段，當然不是唯一檢測純度的手段。中間純化步驟比較多的是首先使用離子交換層析和疏水層析，而后根據(jù)具體情況，可使用等電點聚焦、凝膠過濾層析等其他的層析方法，離心、透析、超濾等其他操作根據(jù)需要而穿插其間。再往后可以用親和層析和金屬螯合層析，不要把親和層析和金屬螯合層析一開始就在中間純化階段使用，因為樣品溶液中的雜質(zhì)太多，會干擾受體-配體的專一性結(jié)合。目的蛋白質(zhì)中的DNA、多糖、脂類、熱源、病毒等非蛋白質(zhì)成分在中間分離純化階段必須要考慮認真去除，雖然粗分離階段已經(jīng)能夠去掉相當多的非蛋白質(zhì)的雜質(zhì)成分。DNA可以用離子交換層析去除，多糖可以用凝集素親和層析去除。理論上將可以用酶水解掉多糖和DNA，然后通過分子篩層析柱而對兩者的降解產(chǎn)物進行去除，但是用于購買酶的費用增加成本太多，而且又加入需要分離純化處理的新的雜蛋白，所以此種分離純化方案不可行。脂類可以通過分子篩層析而與蛋白質(zhì)分離。熱源（腸桿菌的內(nèi)毒素，主要成分是脂多糖）可采用活性炭、石棉等加以吸附，然后離心加以沉淀，而后過濾掉活性炭、石棉（連同吸附的熱源物質(zhì)），留下濾液。另外脂多糖能夠?qū)τ谀承┥锓肿佑杏H和吸附，所以可以用多粘菌素B親和色譜、抗脂多糖的單克隆抗體親和色譜去除掉熱源（腸桿菌的內(nèi)毒素，主要成分是脂多糖）。除了DNA和熱源，蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中必須考慮到來源于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細胞病毒污染。終產(chǎn)物中的細胞病毒污染物主要來源與細胞中的內(nèi)生病毒，因此，充分地對于母細胞庫進行病毒篩選和檢測尤為重要。在細胞株被用于生產(chǎn)前，主細胞庫必須是無病毒的，這將徹底減少在最終的純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中病毒污染的危險。也可專門裝置去除病毒，比如用專門的多孔膜或者空心纖維的超濾管過濾掉病毒。
在親和層析時，我們可以制備出任何一個蛋白質(zhì)的單克隆抗體，而把單克隆抗體共價結(jié)合在凝膠層析柱上，制備成為親和層析柱，作用含有兩種蛋白質(zhì)的溶液過柱時，被單克隆抗體識別并且結(jié)合的那一種蛋白質(zhì)就被粘在了層析柱上，另一個流出去，黏在柱上的蛋白質(zhì)可以用中等濃度（0.1-0.2mol/L）的可溶性配體或者類似物在較溫和的解吸條件下競爭性地置換結(jié)合蛋白質(zhì)。比較常用的較強酸性的洗脫液（比如pH=2.5的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液、5mmol/L的pH=4.0的檸檬酸緩沖溶液）洗脫蛋白質(zhì)。洗脫下來后應(yīng)盡快將洗脫液的pH變?yōu)橹行�，避免目的蛋白質(zhì)失活。
如果蛋白質(zhì)A的C末端有6個組氨酸的尾巴，所以可以用金屬螯合層析的方法加以分離提純，就是使用含有鎳離子的親和層析柱分離純化含有的C末端有6個組氨酸的尾巴的蛋白質(zhì)A。蛋白質(zhì)A會掛在鎳柱上，蛋白質(zhì)B不掛柱，直接流出，先收集蛋白質(zhì)B，而后用20mmol/L磷酸緩沖溶液，200mmol/L咪唑，pH8.0緩沖溶液和20mmol/L磷酸緩沖溶液，400mmol/L咪唑，pH8.0緩沖溶液兩次洗脫下掛在鎳柱上的蛋白質(zhì)A。
第三步是精細分離純化。精細分離純化一般是用凝膠過濾層析和HPLC，這樣可以依靠蛋白質(zhì)的分子量的差別得到比較純的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且能夠去鹽和有機小分子（尤其是在親和層析和金屬螯合層析階段積累的鹽或有機小分子），HPLC過早使用效果不好，雜質(zhì)過多可能會堵住柱內(nèi)的填充介質(zhì)。親和層析和金屬螯合層析一般而言，也不適合作為分離提純蛋白質(zhì)工作的最后一步（具體理由會面會討論）。這三步結(jié)束時，一般目的蛋白質(zhì)樣品的濃度會有所降低，而且會有非緩沖溶液的其他的洗脫液，所以有必要用透析、超濾去除小分子和適當濃縮，以利用產(chǎn)物檢測和保存。
第四步，產(chǎn)物鑒定。一方面需要檢測目的蛋白質(zhì)的純度。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的純度一般可以用SDS-PAGE、蛋白質(zhì)的溶解度是否均一、HPLC、質(zhì)譜、生物功能、肽譜分析等檢測技術(shù)。實際上用紅外傅里葉光譜、紫外光譜和圓二色光譜聯(lián)合檢測蛋白質(zhì)的純度更容易，而且不會損失樣品，即用被檢測蛋白質(zhì)和標準品的有關(guān)光譜參數(shù)加以對比。另一方面要檢測目的蛋白質(zhì)中的熱源、DNA、病毒等非蛋白質(zhì)成分，特別是對于藥用和食用蛋白質(zhì)，可以用FTIR，MS，被檢測的非目的蛋白質(zhì)的雜質(zhì)的生物活性檢測等。第五步，產(chǎn)物保存。一般而言，如果不是冷敏性的蛋白質(zhì)可使用凍干機制備為蛋白質(zhì)干粉狀制劑，然后放入0-4攝氏度的冰箱可長期保存，也可將蛋白質(zhì)放入Eppendorf管，加入適量甘油和緩沖溶液（調(diào)節(jié)好濃度）后封口并貼上標簽，再放入零下70攝氏度冰箱保存。對于冷敏性的蛋白質(zhì)或者不知低溫下是否穩(wěn)定的蛋白質(zhì)不能使用低溫凍干處理，將蛋白質(zhì)放入Eppendorf管，加入適量甘油和緩沖溶液（調(diào)節(jié)好濃度）后封口貼上標簽，再放入零下70攝氏度冰箱保存，并且要分批小包裝，避免反復(fù)凍融。有條件的話，應(yīng)該使用密閉更佳的工業(yè)化的包裝。
需要說明的是，蛋白質(zhì)的分離純化既要考慮蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的比活性也要考慮蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的總活性，不能一味地追求提高比活性而增加分離純化的步驟，因為每一步分離純化都必然會有目的蛋白質(zhì)的凈損失，進而導(dǎo)致總活性的降低。另外大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)除了更加注重總活性外，還需要考慮生產(chǎn)成本，增加不必要的分離純化步驟必然會增加產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。 |
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