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gengpy470新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
鎳柱親和層析純化
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| 求助各位高手，我做的是真核細(xì)胞內(nèi)純化his標(biāo)簽蛋白，做鎳柱親和層析時(shí)在流穿的部分也檢測(cè)到目的蛋白了，我的裂解液里含10mM咪唑，請(qǐng)大家?guī)臀曳治鲆幌略? |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 結(jié)構(gòu)生物學(xué) |
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susizheng
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+5, 麗麗好人！ 2013-11-18 17:25:55
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樓主的問(wèn)題就是帶組氨酸X6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)掛上鎳柱能力差的問(wèn)題，我提示幾點(diǎn)： 1.目的蛋白質(zhì)如果在表達(dá)過(guò)程中一直處于溶解狀態(tài)的，在非變性條件下也能夠和Ni-NTA柱上得到純化。如果形成了包涵體過(guò)著其他不溶性沉淀，可在6mol/L的鹽酸胍或者8mol/LUrea中溶解后上鎳柱。對(duì)于分泌蛋白質(zhì)一般采用非變性條件純化。變性過(guò)程可以用表面活性劑。 2.純化時(shí)可采用變性條件和非變性條件，取決于目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度和（His）6是否能夠暴露在蛋白質(zhì)的分子表面。如果在變性條件或者非變性條件下之一不掛柱，可改換位另一條件，并且改用別的變性劑或者表面活性劑。 大于1mmol/L的DTT會(huì)還原鎳離子而無(wú)法掛柱。 3.如果溶液中存在較高濃度的螯合劑（EDTA/ETGA等）、離子型去污劑、甘氨酸、組胺、含有NH4+離子的試劑等，都會(huì)使得目的蛋白質(zhì)無(wú)法掛上鎳柱。 4.蛋白質(zhì)形成了多聚體、或者與DNA相互作用遮蔽了（His）6位點(diǎn)也會(huì)使得目的蛋白質(zhì)無(wú)法掛上鎳柱。 5.目的蛋白質(zhì)折疊時(shí)形成了遮蔽了（His）6位點(diǎn)會(huì)使得目的蛋白質(zhì)無(wú)法掛上鎳柱，構(gòu)建基因時(shí)（His）6可以在N末端也可以在C末端，但是要處于蛋白質(zhì)的分子表面，而且要與蛋白質(zhì)分子之間最好有一段親水序列，最好能夠引入酶切位點(diǎn)（比如凝血酶酶切位點(diǎn)）。 6.可能在樓主的實(shí)驗(yàn)條件下，被純化的蛋白質(zhì)發(fā)生了聚合，也就是遮蓋了至少一些蛋白質(zhì)分子上的組氨酸X6標(biāo)簽的，洗脫時(shí)實(shí)際上先被洗下來(lái)的不是結(jié)合在鎳柱上靠組氨酸X6標(biāo)簽與鎳離子形成配位鍵的目的蛋白質(zhì)，而是結(jié)合在鎳柱上靠組氨酸X6標(biāo)簽與鎳離子形成配位鍵的目的蛋白質(zhì)以非共價(jià)建附著的目的蛋白質(zhì)。 |
5樓2013-11-09 02:29:23
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