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keven7928至尊木蟲 (知名作家)
水手
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[求助]
求核酸染料有哪些? 已有4人參與
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| 最近在做基因傳遞的試驗,用激光共聚焦觀察材料和基因的胞內(nèi)軌跡,想用YOYO1標(biāo)記DNA,RhB標(biāo)記材料,但是YOYO1太貴了,買不起,還有其他可以用的染料嗎? |

至尊木蟲 (知名作家)
水手

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電泳后,核酸需經(jīng)染色才能顯色出帶型,常用以下核酸染色劑: 1、溴化乙錠(ethidium bromide, EB) 最常用的核酸熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間,在紫外線激發(fā)下,發(fā)出桔紅色熒光。 EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光,比游離的凝膠中的EB發(fā)出的熒光強(qiáng)度大10倍,因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型。若EB背景太深,可將凝膠 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min,使非結(jié)合的EB褪色,這 樣可檢查到10ng的DNA樣品,EB也可用于檢測單鏈DNA或RNA,但其對單鏈核酸的親和力相對較小,熒光產(chǎn)率也相對較低。 在凝膠或電泳緩沖液中加入終濃度為0.5μg/ml的EB,染色可在電泳過程中進(jìn)行,能隨時觀察核酸的遷移情況。但EB帶正電荷,嵌入堿基后增加了 核酸分子的剛性,使遷移率減慢,故不宜用于測定核酸分子量的大小,這時應(yīng)在電泳后將凝膠浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min進(jìn)行染色。EB見光 易分解,應(yīng)于4℃避光保存, 2、吖啶橙(acridine orange, AO): 吖啶橙可嵌入雙鏈核酸堿基對之間,在254nm紫外線激發(fā)下發(fā)出530nm的綠色熒光;還通過靜電與單鏈核酸的磷酸基結(jié)合,在254nm紫外線激發(fā) 下產(chǎn)生640nm的紅色熒光。因此可區(qū)分單鏈和雙鏈核酸,靈敏度分別為0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求嚴(yán)格,應(yīng)在 22℃,0.01mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中避光浸泡30min,然后在搪瓷盤中用該緩沖劑4℃脫色過夜或22℃脫色1~2小時。 3、銀(Ag+)試劑: Ag+與核酸形成穩(wěn)定復(fù)合物,然后用甲醛使Ag+還原成銀顆粒。AgNO3等試劑可使聚丙烯酰胺凝膠上的單鏈,雙鏈DNA及 RNA都染成黑褐色。銀染法的靈敏度比EB染色高200倍左右,比亞甲藍(lán)染色高100~1000倍,在小于0.5mm厚的凝膠中,能檢測出0.5ng的 RNA,其缺點是專一性不強(qiáng),能與蛋白質(zhì),去污劑反應(yīng)也產(chǎn)生褐色,而且對DNA的染色定量不準(zhǔn)確。銀與DNA穩(wěn)定結(jié)合,對DNA有破壞作用,不適于DNA 片段回收的制備。 4、亞甲藍(lán)(methylene blue) 可將RNA染成藍(lán)色,但靈敏度不高,而且操作時間長。染色過程:膠浸泡于0.02%的亞甲藍(lán),10mmol/L Tris-Ac(pH8.3),4℃放置1~2h,用凈水洗5~8h(反復(fù)換水),帶型肉眼可見,最低檢測量為 250ng。 |
木蟲 (著名寫手)

至尊木蟲 (著名寫手)

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