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jezo_新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白總是不表達(dá) 已有1人參與
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最近做蛋白總是不表達(dá)，都是構(gòu)建PET28a上的 有幾個(gè)是以前構(gòu)建好的載體，一直表達(dá)都很好，做小量誘導(dǎo)時(shí)也是正常的，擴(kuò)大后就不表達(dá)了，之后重新做了幾次轉(zhuǎn)化，BL21、Rosseta都試過了，對(duì)菌體做PCR目的片段也還在，但就是沒有表達(dá) 新構(gòu)建的幾個(gè)也是沒有表達(dá) 菌體感覺也是正常的，IPTG、乳糖誘導(dǎo)都試過 因?yàn)槭呛芏鄠�(gè)蛋白都這樣，請(qǐng)各位大神指點(diǎn)一下有可能是什么原因 |
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董博士
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【答案】應(yīng)助回帖
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1、從NCBI上下載的序列是否經(jīng)過優(yōu)化？有些密碼子并不適合在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。 2、如果密碼子優(yōu)化過了，那么表達(dá)載體也會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)。如果PET28a的表達(dá)一直做不出來，建議換一種表達(dá)載體； 3、也有可能是宿主菌的問題，嘗試下其他的感受態(tài)； 4、誘導(dǎo)條件優(yōu)化，誘導(dǎo)劑的量，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和時(shí)間，設(shè)置梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 |
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