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id90銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助TCA沉淀濃度蛋白的問題 已有2人參與
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我做的是畢赤酵母表達(dá)外源蛋白，由于蛋白的表達(dá)量較少，需要濃縮后，電泳分析。 我用的TCA方法是： 1mL 樣品中加入180μL ~ 200μL 預(yù)冷的TCA，充分震蕩，于4℃保存過夜。第二天離心去掉上清，加入200μL預(yù)冷的丙酮，洗滌兩次。沉淀用緩沖液重溶，電泳。 我的問題是：樣品是通過離子交換柱濃縮得到的、具有活性，但是加入TCA后沒有沉淀出現(xiàn)，所以離心去上清的時候我保留幾μL的液體，再加入丙酮，就會有白色沉淀出現(xiàn)。之后進(jìn)行電泳，能看到目的蛋白。是不是TCA不能沉淀出蛋白，而丙酮將蛋白沉淀出來，也有人說丙酮沉淀出的是鹽。求助我的方法是不是有問題，需要怎么改進(jìn)？ |
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2樓2015-03-10 13:33:26
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
id90: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2015-03-12 09:26:06
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首先了解一下TCA沉淀的原理，TCA是酸，可以使蛋白變性，從而沉淀下來，另外TCA可以與蛋白形成不溶性的鹽�？傊甌CA沉淀一般是不可逆的，也就是TCA是用來除雜蛋白的，而且效果是很明顯的，你的樣品加入TCA后沒有沉淀是你的TCA濃度不夠，你加大TCA濃度肯定有沉淀，可以做一個TCA梯度試試。 但是，個人建議，像我上述所說，TCA沉淀一般不可逆，所以建議你TAC沉淀過程盡量使你的目的蛋白保留在上清液中，然后用丙酮再純化一次。 丙酮屬于有機(jī)溶劑沉淀蛋白，是剝離蛋白的水化膜，從而使蛋白分子碰撞沉淀，稀釋后可以復(fù)性。你所說的丙酮沉淀生成鹽是錯誤的，酸還有重金屬沉淀蛋白才會生成鹽。 |
3樓2015-03-10 14:25:42
id90
銅蟲 (初入文壇)
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4樓2015-03-10 16:36:06
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5樓2015-03-10 16:49:38
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具體多少濃度都是做預(yù)實(shí)驗或者查文獻(xiàn)的，不同的蛋白有不同的濃度，我以前做純化時，用過50%也用過75%。這就考察本科時的實(shí)驗功底了。還有離子交換濃縮我只聽說過，具體的沒見過，根據(jù)我多年的純化經(jīng)驗，離子交換濃縮很難實(shí)現(xiàn)，過柱后不稀釋已經(jīng)很難得了，別說濃縮了。你可以問問GE分離純化的技術(shù)部，他們肯定也不建議使用離子交換濃縮。至于TCA和丙酮他們其實(shí)是起到一個生物富集作用，純化還是要過柱子的。純化后再濃縮就不能在引入其他成分了（置換緩沖液除外），這是要考慮用PEG或者超濾管濃縮，有錢的就用分子篩干膠，轉(zhuǎn)固體用凍干，真空干燥也可以考慮。噴霧干燥不適合。 |
6樓2015-03-10 20:09:25
7樓2015-03-10 20:19:51
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