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liaona銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細(xì)菌PCR總是點(diǎn)的有些樣不出條帶 已有6人參與
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提取土壤總DNA，利用細(xì)菌V6-V8區(qū)引物968F/1401R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，點(diǎn)的樣總是有那么幾個(gè)不出條帶，不清楚什么情況，有師姐說是我做PCR加樣操作出問題，可是每次做8個(gè)，加樣操作都是一樣的啊，怎么就有些樣p出來，有些沒有出來呢。PCR25ul體系：上下游引物各1.5ul，2.5mM each dNTPs 2ul，10xPCR Buffer 2.5 ul，Taq聚合酶0.25ul，模板DNA 2 ul，無菌水 15.25 ul。PCR擴(kuò)增條件：94 oC變性5min,接著20個(gè)循環(huán)（94 oC變性1 min，67 oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5 oC），接著 15個(gè)循環(huán)（94 oC變性1 min，57oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每個(gè)循環(huán)退火溫度降0.5 oC），最后再72 oC延伸10 min。 10.30.2.jpg |
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ahuasuo123
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樓主，看了一下你的體系和程序，可能有以下幾個(gè)問題：首先，引物濃度有點(diǎn)大了，引物濃度太大有時(shí)會(huì)影響擴(kuò)增的，你的25微升的體系可以加0.5～1微升。其次模板量太大了，模板你可以用核酸定量儀測(cè)一下，也可以用分光光度計(jì)測(cè)，像你25微升的體系加25ng就足夠了。再其次，你的退火溫度開始太高了，普通的taq酶擴(kuò)增能力很強(qiáng)，五十五度，不用梯度就可以。再其次，你確定一下你用的taq酶的濃度，我感覺是高了，普通沒有預(yù)混的taq酶的濃度是很高的，酶濃度過高影響擴(kuò)增效率。再其次，如果pcr儀不是很好的話，放在邊緣上的樣品有時(shí)會(huì)發(fā)生擴(kuò)增不出來的現(xiàn)象！ 所以，總的建議是，25微升體系，引物加1微升，根據(jù)taq酶的說明書按照標(biāo)準(zhǔn)加酶，退火不用梯度，直接55度30個(gè)循環(huán)，總一個(gè)EP管，把樣全在一個(gè)管子加好，最后分裝！最后把樣都放在pcr儀的中間處！ 祝你好運(yùn)！ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
7樓2015-03-17 07:53:26
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2樓2015-03-16 18:02:47
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3樓2015-03-16 18:24:44
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4樓2015-03-16 19:32:39
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那你使用的引物是針對(duì)某種細(xì)菌的還是所有的都有��？如果是特異的話，會(huì)不會(huì)這種土壤中不含有這種菌？如果不是特異的，就自己再重新做一次PCR試試？還有就是你自己要確定你都提取到了DNA，這個(gè)問題可以通過測(cè)定每種土壤菌的DNA濃度，并且可以通過計(jì)算使得每種土壤菌的模板中含有相同的DNA，這樣更能說明模板的問題還是其他操作的問題。因?yàn)槿绻鸇NA濃度差異很大的話，使用同一臺(tái)PCR儀同時(shí)進(jìn)行PCR最終的DNA差異會(huì)越來越大的，跑膠顯示是需要一定量的DNA 才可以的啊。祝你成功啊~ |
5樓2015-03-16 21:46:21
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 引物濃度大模板濃度大，濃度高應(yīng)該總會(huì)擴(kuò)增出來吧，何況你也不是太大的，認(rèn)為濃不是問題，引物的特異性還差不多，你也說了你的引物是針對(duì)總細(xì)菌的，所以不能說是及特異的，只是第一個(gè)原因吧。其次，普通Taq酶擴(kuò)增能力是很強(qiáng)，擴(kuò)增較快，但是它擴(kuò)增效率不高啊，如果是檢測(cè)有沒有不考慮擴(kuò)增特異性的話，使用普通的Taq酶，稍微高要求的實(shí)驗(yàn)建議使用熱啟動(dòng)Taq聚合酶，更高要求的用高保真聚合酶（一般不建議使用） |
8樓2015-03-17 09:04:23
9樓2015-03-17 09:43:50
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