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liaona銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
細(xì)菌PCR總是點的有些樣不出條帶 已有6人參與
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提取土壤總DNA，利用細(xì)菌V6-V8區(qū)引物968F/1401R進行PCR擴增，點的樣總是有那么幾個不出條帶，不清楚什么情況，有師姐說是我做PCR加樣操作出問題，可是每次做8個，加樣操作都是一樣的啊，怎么就有些樣p出來，有些沒有出來呢。PCR25ul體系：上下游引物各1.5ul，2.5mM each dNTPs 2ul，10xPCR Buffer 2.5 ul，Taq聚合酶0.25ul，模板DNA 2 ul，無菌水 15.25 ul。PCR擴增條件：94 oC變性5min,接著20個循環(huán)（94 oC變性1 min，67 oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每個循環(huán)退火溫度降0.5 oC），接著 15個循環(huán)（94 oC變性1 min，57oC退火1 min，72 oC延伸1 min，每個循環(huán)退火溫度降0.5 oC），最后再72 oC延伸10 min。 10.30.2.jpg |
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ahuasuo123
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樓主，看了一下你的體系和程序，可能有以下幾個問題：首先，引物濃度有點大了，引物濃度太大有時會影響擴增的，你的25微升的體系可以加0.5～1微升。其次模板量太大了，模板你可以用核酸定量儀測一下，也可以用分光光度計測，像你25微升的體系加25ng就足夠了。再其次，你的退火溫度開始太高了，普通的taq酶擴增能力很強，五十五度，不用梯度就可以。再其次，你確定一下你用的taq酶的濃度，我感覺是高了，普通沒有預(yù)混的taq酶的濃度是很高的，酶濃度過高影響擴增效率。再其次，如果pcr儀不是很好的話，放在邊緣上的樣品有時會發(fā)生擴增不出來的現(xiàn)象！ 所以，總的建議是，25微升體系，引物加1微升，根據(jù)taq酶的說明書按照標(biāo)準(zhǔn)加酶，退火不用梯度，直接55度30個循環(huán)，總一個EP管，把樣全在一個管子加好，最后分裝！最后把樣都放在pcr儀的中間處！ 祝你好運！ [ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
7樓2015-03-17 07:53:26
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5樓2015-03-16 21:46:21
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