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emma的小胖新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
Red重組的引物設(shè)計(jì)問(wèn)題 已有1人參與
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我完全按照文獻(xiàn)的敲除引物序列，用Red重組進(jìn)行敲除大腸桿菌ClpP基因，引物設(shè)計(jì)如下： 上游引物：50bp的基因上游同源序列+20bp的pKD3配對(duì)序列 下游引物：50bp的基因下游同原序列+20bp的pKD3配對(duì)序列 此方法敲除成功了。 但是我用相同的策略敲除DnaK基因的時(shí)候卻無(wú)論如何也篩不到交換菌株（即DnaK基因被氯霉素基因替換掉的）。用的是跟上面相同的pKD3配對(duì)序列，只是把前面50bp換成DnaK的上下游同源序列，實(shí)驗(yàn)方法與敲除ClpP基因時(shí)是完全一樣的，可是就是敲除不掉。 我想請(qǐng)教一下，這樣的情況最可能是什么原因呢？是不是因?yàn)?0bp同源臂，那么應(yīng)該怎么設(shè)計(jì)同源臂的序列？我之前設(shè)計(jì)的50bp同源臂能夠保證它與DnaK基因上下游的序列同源，但是沒(méi)有考慮GC含量之類的其他條件，會(huì)有些什么因素影響引物設(shè)計(jì)呢？ |
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emma的小胖
新蟲(chóng) (初入文壇)
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2樓2015-03-31 17:00:05
張凡云
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3樓2015-05-31 13:37:37
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