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明太魚金蟲 (初入文壇)
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[求助]
連接載體相關(guān) 已有4人參與
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最近一直在做連接，持續(xù)兩個月了，每次都只長假菌落，基因三百多bp，連到了18T上，選擇了BanHI和SpeI切（因為沒有合適的酶切位點，在基因的非開放讀碼框處選擇了SpeI）并回收，濃度不高大約10納克左右。 連表達(dá)載體，問題就出現(xiàn)了，表達(dá)載體上這兩個酶切位點距離較近中間只有一個XbaI，不知道是不是這個原因，不論是分別切還是直接雙切的都連不上，而且分別切和直接雙切后的載體不在一條線上，找了很多辦法，為了防止假陽性甚至又將酶切后的載體去磷酸化，假陽性是少了可是沒出真的。 用的都是1:3的比例，感受態(tài)用的是實驗室做的Top10,雖說自己做的可能沒有買的好，但是其他同學(xué)用也都連上了，我就不知道該怎么辦了，請各位大神指點一二。 |
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明太魚
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